分子标记在烟草性状连锁基因定位中的应用进展

罗昭标，陈欢，毛华，占资抚，王木荣

1.抚州市烟草公司 资溪分公司，江西 抚州 335300；2.南昌工学院 民族教育学院，江西 南昌 330108；3.红塔辽宁烟草有限责任公司，辽宁 沈阳 110002

烟草是茄科烟属的重要经济作物，烟叶是其主要收获器官。自我国烟草行业大企业、大品牌、大市场发展战略实施后，为提高优质烟叶供应能力，国家烟草专卖局从2004年开始开展部分替代进口烟叶生产示范工作，2009年6月30日，下发了《国家烟草专卖局关于启动特色优质烟叶开发重大专项的通知》，标志着涉及烟草工业、商业企业和相关研究机构的特色优质烟叶开发重大专项正式启动[1]。研究烟草特色优质性状，如高香气、高抗病性状，定位及分析特殊性状连锁基因，培育优质烟叶品种，是开发特色优质烟叶，构建中式卷烟优质特色烟叶原料保障体系的重要任务。

烟草性状基因定位是指将性状连锁基因定位于某一特异的染色体上，测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离[2]。传统的基因定位主要采用形态性状的标记及同工酶标记，是对基因的间接反映。而分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。自1974年Grozdicker等[3]建立了第一个分子标记以来，分子标记在作物遗传育种中得到广泛应用。烟草各种分子标记遗传连锁图的相继建立[4-6]，为烟草性状的基因定位及分子标记辅助选择奠定了良好基础。我们简要综述分子标记在烟草化学、普通农艺和抗病性等性状连锁基因定位中的应用进展，讨论其存在的问题，展望其应用前景，以期为分子标记应用于烟草性状连锁基因定位和特色优质烟叶育种分子标记辅助选择研究提供借鉴。

1 分子标记技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记[2]。现已有几十种分子标记，按技术基础可分为基于分子杂交技术、PCR技术、限制性酶切结合PCR技术和DNA芯片技术等4类[7]。常用于烟草研究的分子标记有扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）、随机扩增多态性 DNA（ran⁃dom amplified polymorphic DNA，RAPD）、特异序列扩增多态性（sequence specific amplification poly⁃morphism，SSAP）、特征序列扩增区域（sequencecharacterized amplified regions，SCAR）等[8]。

2 烟草化学成分连锁基因定位

特色优质烟叶具有化学成分、物理特性、内在品质和安全性等方面的特殊性，其中化学成分对物理特性、内在品质和安全性有重要影响。化学成分一般属于数量性状，运用分子标记技术建立遗传连锁图做QTL分析，可更精确、有效地选择最优基因型[9]。

早在2006年，Julio等[10]对烤烟化学成分连锁基因做了大量工作，通过AFLP、ISSR、SSAP、SCAR分子标记对33个烟草化学指标进行定位，包括近红外光谱检测的烟碱、焦油、石油醚提取物、氯、氮、多酚类等18种成分，高效液相色谱检测的总碱、烟碱、假木贼碱、去氢新烟碱、降烟碱和干物质等6种成分，卷烟相关的CO、焦油、烟碱、总粒相物、苯并［α］芘等9个指标。国内肖炳光等[9]与李华丽等[11]利用ISSR、RAPD、SRAP分子标记分析烤烟品种，分别发现了与总糖、烟碱、氧化钾3种烟叶化学成分相关的7个加性效应QTL、2个烟碱相关QTL、2个总氯相关QTL、1个总钾相关QTL。

而针对具有特殊香气的“大白筋599”，常爱霞[12]用RAPD引物Y466分析了“大白筋599”、一般香气的“G28”及其Fl和F2的17个单株，结果表明扩增出的多态性片段可能是与“大白筋599”的特殊香气性状连锁的分子标记。

白肋烟是中式混合型卷烟的重要原料，分子标记也逐步用于白肋烟的研究。柴利广[13]通过SRAP和AFLP分析，发现有2个QTL位点与白肋烟烟碱合成连锁，1个与总氮含量连锁，并且3个位点在同一区间。蔡长春等[14]也用上述2种分子标记检测到与烟碱（2个）、总氮（2个）和总糖（3个）相关的QTL，未检测到与总钾相关的QTL。

我国烟草界一直关注卷烟的“减害”，烟草化学成分是卷烟有害成分的来源或前体物。目前化学及物理手段的“减害”逐渐陷入瓶颈，通过基因工程控制烟草有害成分前景广泛。利用分子标记技术定位有害成分或前体物的控制基因，通过基因工程手段抑制其遗传表达，可以从根本上降低烟草有害成分。

3 烟草普通农艺性状连锁基因定位

烟草的农艺、品质等重要性状多为数量性状，易受环境影响，根据表型进行育种选择效率低。烟草普通农艺性状连锁基因定位大多集中于影响烟叶产量的相关性状研究。

2006年，Julio等[10]分析化学成分连锁基因的同时，对烟叶采摘时间（5因素）、烟叶采后重量（5因素）、烟叶质量（5因素）、烟叶生长发育（5因素）、腋芽量、田间颜色、开花时间、形态类型、烟茎比重和地面总产量等26个烟草农艺性状指标进行了定位。

国内烟草研究人员已利用SRAP、SSR、AFLP、ISSR对烤烟株高、茎围、节距、叶片数、最大腰叶长、最大腰叶宽[15]、中部叶长[14]、茎叶夹角[11]、叶片数、脚叶长、脚叶宽、腰叶长[16]的相关QTL进行定位。张吉顺等指出，其研究中与株高、叶片数、脚叶宽和腰叶长稳定关联的SRAP标记可应用于分子标记辅助选择及候选基因研究。以上研究均未发现开花天数、成熟天数、顶叶长、顶叶宽、主侧脉角、总叶数和中部叶宽相关的QTL。杜传印[17]和谭效磊[18]采用杂交方法，分别通过AFLP和SSR分析，找到一个与控制白肋型叶色性状基因相连锁的AFLP标记，检测得到易烤性相关的4个QTL。

烟草普通农艺性状一直是烟农关注的焦点，主要表现为烤烟的烟叶产量和易考性。将分子标记技术应用于提高产量与质量矛盾下的烟叶产量，是一个重要的研究方向。

4 烟草抗病性连锁基因定位

目前，分子标记技术在烟草抗病性连锁基因定位中应用最多，抗病性也属于农艺性状，由于研究报道较多，因此单独列出论述。

4.1 烟草真菌病抗性基因定位

烟草常见的真菌病害有根黑腐病、赤星病、黑胫病、炭疽病、猝倒病和霜霉病等，其中烟草霜霉病在我国没有发生病害。

据现有文献报道，烟草研究人员利用分子标记分析出了2个对抗烟草根黑腐病RAPD标记[19]、1个抗白粉病相关QTL[11]、3个与抗赤星病相关QTL[20]、1个抗赤星病RAPD标记[21]、1个抗赤星病SSR标记[22]、2个抗黑胫病RAPD标记[23-24]、7个黑胫病抗性相关QTL[25]和1个抗黑胫病SSR标记[26]。以上分子标记均可用于烟草育种中的分子标记辅助选择。

4.2 烟草细菌病抗性基因定位

烟草常见的细菌病害有青枯病、野火病、角斑病和细菌性黑茎病等，其中研究较多的是烟草青枯病。

Nishi等[27]利用AFLP标记将对应于青枯病抗性的一个QTL位点及与之相联系的DNA标记定位到一个32 cM长、包含15个标记的连锁群中，另发现2个共显性标记M82和M84都与抗性基因连锁。杨友才等[28]选用高感和高抗青枯病品种进行RAPD分析，筛选出一个与抗青枯病基因连锁的RAPD片段。

徐秀红[29]从423个RAPD引物中筛选到与野火病抗性基因紧密连锁的RAPD标记S522000。Yi等[30]对1500个RAPD引物进行筛选，鉴定了5个与烟草野火病抗性基因连锁的RAPD标记。Milla等[31]将筛选到的2个烟草霜霉病抗性基因的RAPD标记转化为SCAR标记，并指出在大田、辅助标记选择中，这2个SCAR标记可用于鉴定烟草是否有霜霉病抗性。

4.3 烟草病毒病抗性基因定位

烟草常见病毒病有烟草普通花叶病毒（TMV）病、黄瓜花叶病毒（CMV）病、蚀纹病毒病、马铃薯Y病毒（PVY）病和番茄斑萎病毒病等。

范静苑等[32]用135对SSR引物进行分子标记分析，得到标记SM1350与源于铁把子的CMV抗性基因间的遗传距离为8.64 cM，标记SM2270与源于台烟8号的CMV抗性基因间的遗传距离为3.92 cM。

Noguchi等[33]用只在PVY抗性上有差异的烟草NIL进行RAPD分析，找到10个标记，这些标记只在感病品种中存在，并经过Southern杂交证实。王贵等[34]从多条RAPD引物和一对SCAR引物中，筛选出2个与PVY抗性基因紧密连锁的分子标记，并指出二者可用于抗PVY抗性育种。

高玉龙等[35]通过分子标记分析结合田间TMV抗性鉴定，发现TMV抗性基因位于标记N2和XS⁃RP1x26之间，标记与品种（系）的TMV抗性吻合率达97.62%。许石剑[36]分析了Ti245抗TMV的遗传规律，并对抗性基因进行SSR标记定位，发现Ti245抗TMV的位点位于LG9连锁群，标记*Tp217200距目的基因最近，遗传距离为3.3 cM。

Moon和Nicholson[37]利用AFLP建立了3个与烟草番茄斑萎病毒抗性基因紧密连锁的标记，并进一步转化为SCAR标记。

4.4 烟草虫害抗性基因定位

已发现6种烟草线虫病害，分别是烟草南方根结线虫病、北方根结线虫病、爪哇根结线虫病、花生根结线虫病、烟草孢囊线虫病和草原线虫根褐腐病。

Yi等[38]利用RAPD标记分析根结线虫抗性基因，将16个RAPD标记定位在24.1 cM距离内的6个位点上，其中6个RAPD标记定位在Rk位点。王扬等[39]发现RAPD引物OPJ13能在所有感根结线虫病品种中扩增出一条780 bp的片段，而该片段在所有抗病品种的扩增产物中均未发现，因此此标记极有可能是与烟草感病基因相连锁的分子标记。

烟草病害多达116种以上，仅我国烟草上侵染性病害已达68种以上，且新的病害在不断增加。烟草病害是影响烟叶产量和质量的重要因素。加强分子标记定位烟草抗性基因，进一步利用基因工程技术培育烟草抗病品种，具有广阔的发展前景。

5 讨论与展望

5.1 加强新型分子标记技术在烟草中的应用

分子标记技术可以运用于烟草品种鉴定、种质资源分析、遗传分析、基因定位、辅助选择、病虫害分析等多方面的研究。从总体上看，分子标记在烟草上的运用，目前取得的进展也还相对落后与其他作物如水稻、小麦等。如稳定性更高的SCAR标记，仅应用于烟草品种鉴定和基因定位等方面[40-41]；多态性丰富的、能反应单核苷酸变异的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）标记，在烟草中的应用尚属空白[42]。因此，配置相关设备和软件，加强新型分子标记技术在烟草中的应用，是烟草研究人员的重要任务。

5.2 加强烟草特殊性状的基因定位与分析

近年来，由于安全性和重金属等问题，烟草处于舆论漩涡中心。运用分子标记技术加强烟草有害化学成分的连锁基因研究，开发特色优质、安全性高的烟叶品种，从品种开始“减害降焦”，是烟草农业发展的趋势。加强烟草高香气性状连锁基因的研究，培育特色香气烟草品种，对建立特色风格、特色香气的“中式卷烟”原料基础具有重要意义。

5.3 加强分子标记在野生烟草性状中的研究

目前已发现的烟属作物有66种，其中多数是野生种，被烟草行业栽培利用的只有红花烟草（Nicoti⁃ana tabacum L）和黄花烟草（N.rustica L）[43]。虽然野生烟草没有经济价值，但其独有的某些抗病性、香气成分等性状是普通烟草所欠缺的。考察野生烟草特殊性状的优良性，利用分子标记定位其连锁基因，将其引入普通烟草育种，可为解决我国在烟草育种上面临的过度依赖主体亲本、育成品种遗传基础狭窄、主要性状趋同等问题开辟新途径。

5.4 加强特殊性状连锁基因定位的后续研究

大多数研究集中于定位烟草特殊形状连锁基因，对连锁基因的序列分析、表达形式及作用机理等的研究较少。因此，要进一步加强特殊性状控制基因定位的后续研究，掌握连锁基因的作用机理，将其运用到烟草基因工程育种中，为培育高抗性、适合工业需求的新品种提供新途径。

5.5 加强研究资源的合理配置

目前，国内研究烟草分子标记、基因工程育种的人员较多，高校、研究所、工业及商业企业都有相关研究人员。应合理分配研究资源，避免同类研究，对减少资源浪费，加快研究进度都有重要意义。地方研究人员应注重当地烟草流行病害的研究。

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