丙型肝炎病毒基因型与丙型肝炎患者自身抗体的相关性

王笑颜，邹伟华，邵圣文，钱福初，王　翔

(湖州市中心医院检验科，湖州师范学院微生物与免疫学研究室，浙江湖州 313000)

丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起。HCV可直接损伤肝细胞，同时还伴有免疫系统损伤和肝外病变，成人感染HCV后有60%～80%会发展为慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)。HCV为单股正链RNA病毒，其基因序列呈现多态性和高度变异性。近年来，Simmonds等[1]根据HCV基因组序列分型法，将HCV分为6种基因型和31种亚型。初步证据表明，HCV感染与自身免疫关系密切。本文就HCV不同基因型感染与自身抗体变化的关系进行研究，有助于探讨HCV发病机制和其感染对机体免疫功能的影响，为临床治疗提供依据。

资料和方法

对象及样本分组

湖州市中心医院2008年1月至2010年1月传染科门诊和住院患者中HCV RNA阳性患者，诊断标准符合全国病毒性肝炎防治方案[2]，所有患者排除甲、乙、丁、戊型肝炎病毒感染。抗病毒治疗前抽取静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清置-70℃冻存备用。对照组为本院健康体检者，均HCV RNA<8×104/L。

血清样本按照HCV RNA病毒载量分为3组，HCV RNA≥108/L为高病毒载量组，108～105/L为中载量组，105～8×104/L为低载量组。

试剂与方法

HCV RNA检测：定量检测采用实时荧光定量法，由广东达安基因股份有限公司生产的HCV荧光定量PCR试剂盒检测。HCV基因扩增采用Trizol法提取病毒RNA参考文献[3]，以RT-nest PCR扩增HCV RNA 5′-NCR区，引物委托美国Invitrogen上海公司合成。在EPPENDORF mastecycler PCR仪上进行扩增，取10 μl RNA为反转录模板，经过逆转录反应得到互补cDNA，-70℃保存。第一轮PCR扩增：以5 μl互补cDNA为模板，以外引物进行扩增，参数为94℃变性10 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min 50 s 72℃ 1 min，共25个循环，72℃ 10 min延伸。第二轮PCR扩增：取第一轮PCR产物2 μl为模板，以内引物扩增，参数为94℃变性10 min，94℃ 1 min 55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环72℃ 10 min延伸。取第二轮PCR产物5 μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察鉴定。HCV序列测定及基因分型PCR产物测序由迪安医学检验中心以ABI3130全自动测序仪完成。将测序结果输入美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因分型软件，经比对后获得基因分型结果(分型软件网址参见www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。

自身抗体检测：采用间接免疫荧光法检测抗核抗体(anti-nuclear antibody，ANA)、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscle antibodies，ASMA)。采用斑点免疫印迹法检测抗线粒体抗体M2、Sm、RO52、SSA、SSB及抗着丝点抗体(centromere antibody，CENPB)。以上检测试剂均由德国欧蒙公司提供。待测血清1∶100为起始稀释度，检测阳性血清分别进行1∶320、1∶1000、1∶3200稀释度以确定最终滴度。类风湿因子(rheumatoid factor，RF)采用散射比浊法，在Beckman-Immage仪器上检测，试剂由美国贝克曼公司提供。

统计学处理

采用SSPS 19.0软件进行数据分析，计量资料采用t检验，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

基本资料

HCV RNA阳性者94例，男55例，女39例；年龄15～79岁；CHC 89例，丙型肝炎后肝硬化5例，所有患者抗HCV-抗体均为阳性。对照组70例，男32例，女38例；年龄23～66岁。

HCV基因型分布

94例HCV RNA阳性者中，1a型5例(5.3%)，1b型77例(81.9%)，2a型9例(9.6%)，3a型1例(1.1%)，6a型2例(2.1%)。

自身抗体检出率

94例HCV RNA阳性者共检出37例(37/94，39.4%)自身抗体阳性；其中1b型检出36例自身抗体阳性者，检出率为46.8%(36/77)；2a型检出1例自身抗体阳性，检出率为11.1%(1/9)，两者检出率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其他基因型未检出自身抗体阳性。

36例自身抗体阳性1b型者ANA阳性36例次，RF阳性21例次，SSA阳性8例次，RO52阳性8例次，SSB阳性7例次，M2阳性5例次，CENPB阳性4例次，ASMA阳性3例次。1例自身抗体阳性2a型者，表现为ANA、RF及M2阳性。

HCV基因型与ANA的关系

94例HCV RNA阳性者中，ANA阳性者37例。滴度1∶100者占59.5%(22/37)，滴度1∶320者21.6%(8/37)，滴度1∶1000者占18.9%(7/37)。ANA荧光图型检测结果以颗粒型为主，占62.2%(23/37)，其次是丝点型(16.2%，6/37)，其他为核仁型和均质型。

HCV病毒载量与ANA检出率的关系

94例HCV RNA阳性者中，高、中、低载量组分别为20、38、36例。3个载量组分别与对照组比较，差异均有统计学意义(χ2分别为6.4、19.9、53.1，均P<0.05)。高载量组和低、中载量组比较，差异均有统计学意义(χ2分别为19.5、9.8，均P<0.05)(表1)。

讨　　论

多种病毒感染可诱发自身免疫反应。1989年Esterban等[4]在自身免疫性肝炎患者血清中检出ANA，随后HCV感染与自身免疫的关系引起广泛关注[5]。HCV感染可通过分子模拟现象激活自身免疫反应性CD8+细胞，从而导致自身免疫[6]。

HCV基因组呈现高度变异性，这是HCV感染容易导致慢性化的主要原因。目前Simmonds等将HCV分为6个基因型，邹伟华等[7]采用RT-nest PCR后直接测序法分析不同丙型肝炎患者血清HCV基因型。本研究结果显示，湖州地区流行的HCV基因型主要为1b型，其次为2a型，与国内主要流行趋势相一致。本研究检测了湖州地区不同HCV基因型患者体内自身抗体情况，结果表明1b型患者检出率为46.8%，与国内已有报道[8]相近。2a型检出率为11.1%，其他基因型均未检出自身抗体。这与国外报道不一致，Zein等[9]报道1a型HCV感染与自身免疫的相关性较为明显，1b型HCV感染次之。这可能是由于研究对象种族不同造成的。葛明才等[10]研究表明，1b型HCV感染确与自身免疫明显相关，提示HCV感染可能可诱导自身免疫反应，另外，研究还提示这种免疫反应与疾病严重程度及病程长短有关。

表1　丙型肝炎病毒RNA含量与抗核抗体检出率

本文观察到，94例不同基因型丙型肝炎患者中，1b型可检出ANA、RF、ASMA、M2、SSA、RO52、SSB、CENPB这8种自身抗体，2a型检出ANA、RF和M2这3种自身抗体。有研究认为，自身免疫疾病的启动因子是病毒感染，靶细胞中的抗原成分改变或者由于病毒蛋白正常组织成分间有同源性而诱发自身免疫，并认为HCV感染可通过分子模拟现象激活自身反应性CD8+T细胞，从而诱导自身免疫[11]。本文还观察到，1b型和2a型HCV-RNA自身抗体以低滴度为主。然而，一般认为自身抗体在高滴度时才与自身免疫病密切相关。当前，HCV治疗主要应用α-干扰素，该药可诱导或增强自身免疫，存在高滴度自身抗体者应用时可能会使病情恶化。另外，自身免疫性疾病可应用糖皮质激素类药物治疗，但该类药物可促进病毒复制。张路等[12]认为，慢性HCV感染相关的自身免疫性疾病在临床表现及实验室检查特征上与未合并慢性HCV感染者相比无差异，使用糖皮质激素联合免疫抑制剂治疗仍安全有效。有学者认为，给予ANA滴度<1∶320者应用α-干扰素治疗后不会出现病情恶化[13]。因此，对低滴度自身抗体的HCV患者，不应推迟干扰素的治疗；而对于治疗过程出现高滴度自身抗体的HCV患者，进行自身抗体检测和滴度监测有助于了解患者自身免疫状态并指导治疗，对患者治疗及愈后有重要临床意义。

另外，也有研究表明，高滴度(≥1∶320)自身抗体常提示自身免疫性肝炎的存在[14]。本文检测出的A-SMA和M2也是自身免疫性肝病的特征抗体，提示HCV患者可能合并自身免疫性肝炎。

本研究发现，随着HCV病毒载量增加，ANA阳性率也随之增加，说明ANA阳性率与HCV病毒复制有关。Yuki等[15]检测了71例HCV携带者，发现ANA在高病毒血症(108～109copies/ml)中为阳性，提出自身抗体的出现可能与病毒的高水平复制有关。因此，当HCV患者自身抗体阳性，可能提示肝脏和免疫系统同时受累，此时病毒可能处于高复制状态，应选择合理治疗方案，做到既能控制病毒复制，也不累及免疫系统。总之，丙型肝炎患者自身抗体与HCV基因型有关，对其开展自身抗体检测有利于HCV治疗。

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