甲泼尼龙琥珀酸钠、环磷酰胺、甲氨蝶呤穿透神经精神狼疮患者血脑屏障的能力

陆　慧，郑　昕，胡　蓓，张奉春#

(首都医科大学宣武医院神经内科，北京 100053)

神经精神狼疮(neuropsychiatric systemic lupus erythematosus，NPSLE)是指系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)神经系统损害相关的神经精神表现，其发病率为14%～75%[1]。目前，国内NPSLE急性期主要采用大剂量甲泼尼龙琥珀酸钠(methylprednisolone sodium succinate，MPSS)500～1 000 mg/d或加用环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)静脉冲击，联合鞘内注射甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)和地塞米松的治疗方案。

与正常人相比，NPSLE患者的血脑屏障易受破坏或发生通透性改变，药物穿透血脑屏障进入脑脊液的程度可能有所改变。但是，目前对于NPSLE患者激素和免疫抑制剂穿透血脑屏障的研究相对较少，现行的治疗方案在脑脊液局部是否可以有效尚缺乏可靠证据支持。本研究拟通过前瞻性研究方法，收集NPSLE患者血液及脑脊液样本，建立在人血浆与脑脊液中MPSS、CP和MTX的定量分析方法并测定其浓度，评价这3种药物穿透NPSLE患者血脑屏障的能力。

材料和方法

样本收集及分组

全部患者均来自2011年12月至2012年5月北京协和医院住院且均确诊为NPSLE患者。诊断参考1999年美国风湿病协会(American College Of Rheumatology，ACR)NPSLE命名和定义分类标准。所有患者均因病情需要正在接受3种方案(静脉滴注MPSS、静脉滴注CP和口服MTX)中1种或多种治疗，试验期间收集其血液及脑脊液样本。所有患者均自愿签署知情同意书。

试验用药

MPSS组：注射用MPSS粉末，比利时辉瑞医药公司生产。MPSS粉末溶于100 ml/250 ml葡萄糖溶液中，每位受试者一次静脉滴注40或500或1 000 mg MPSS，滴注速度为40～60滴/min，输注时间至少为30 min。

CP组：注射用CP粉末(0.2 g/瓶)，中国江苏恒瑞医药股份有限公司生产。每位受试者一次静脉滴注0.4或0.8 g CP。给药前1周内未使用过CP。CP粉末溶解于100 ml生理盐水中，滴注速度为40～60滴/min，输注时间至少滴注30 min。

MTX组：MTX片剂(2.5 mg/片)，中国上海信谊制药厂生产。每位受试者一次口服10 mg或15 mgMTX，服药前1周内未使用过MTX。

仪器及试剂

仪器：超高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

对照品：琥珀酸甲泼尼龙(中国食品药品检定研究院)，环磷酰胺(中国食品药品检定研究院)，甲氨蝶呤(中国食品药品检定研究院)。

内标：4′-氨基苯乙酮(美国Sigma Inc.公司)

试验方法

按药物在血浆和脑脊液中达峰时间采集样本，并测定其浓度。

血液样本采集：MPSS组分别于静脉滴注30 min和6 h后采集静脉血样本各3 ml；CP组于静脉滴注60 min后采集静脉血样本3 ml；MTX组于口服100 min后采集静脉血样本3 ml。采血均采用血浆肝素锂抗凝管。静脉血样本于4℃、1 500转/min×15 min条件下分离得到血浆，放置于-80℃冰箱冻存备用。MPSS组以MPSS和甲泼尼龙(methylprednisolone，MP)浓度之和表示。

脑脊液样本采集：MPSS组于静脉滴注6 h后采集脑脊液样本1 ml；CP组于静脉滴注60 min后采集脑脊液样本1 ml；MTX组于口服100 min后采集脑脊液样本1 ml。脑脊液样本放置于-80℃冰箱冻存备用。

浓度测定：建立超高效液相色谱/质谱串联(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry， UPLC-MS/MS)定量方法并对其进行了考核，同时确认血浆中MPS、CP和MTX的稳定性。

统计学处理

采用SPSS 19.0、Analys(美国AB Sciex公司)、SAS(美国SAS公司)软件。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

基础资料

共纳入MPSS组14例，CP组10例，MTX组11例患者，均为女性。

MPSS组

MPSS组样本血浆和脑脊液MPSS+MP峰值浓度为0.11%～3.72%，均值为(0.75%±0.90%)。3.72%为超出±3倍标准差的离群值，考虑为测量误差或个体差异所致，予以舍弃。剔除异常数据，峰值浓度比为0.11%～1.00%，均值为(0.52%±0.30%)(表1)。

相关系数矩阵及检验，给药6 h后血浆与脑脊液MPSS+MP浓度存在线性关系，回归方程为Y=0.131X+1.043，R=0.929，P=0.000，相关系数有统计学意义，线性关系显著(图1)。

CP组

CP组脑脊液和血浆峰值浓度为13.73%～32.94%，平均值为(22.74%±7.42%)(表2)。同期血浆和脑脊液CP浓度无正相关性。

表1　14例甲泼尼龙琥珀酸钠组患者用药后血浆及脑脊液甲泼尼龙琥珀酸钠+甲泼尼龙浓度

图1甲泼尼龙琥玻酸钠组患者给药6 h后血浆与脑脊液甲泼尼龙琥珀酸钠+甲泼尼龙浓度线性图

Fig1Linear graph of methylprednisolone sodium succinate + methylprednisolone concentrations in plasma and cerebrospinal fluid after 6h in methylprednisolone sodium succinate group

表2　10例环磷酰胺组患者血浆和脑脊液环磷酰胺浓度

MTX组

MTX组脑脊液与血浆峰值浓度为0～28.82%，均值为(2.78%±8.65%)(表3)。28.82%为超出±3倍标准差的离群值，予以舍弃。剔除异常数据后峰值浓度比为0～1.52%，平均值为(0.18%±0.48%)。同期血浆和脑脊液MTX浓度无正相关性。

讨　　论

本研究为前瞻性、随机的药物试验，收集了MPSS、CP和MTX患者血液及脑脊液样本，建立人血浆和脑脊液中MPS、CP和MTX的UPLC-MS/MS定量测定方法。方法学考核的各项结果均符合国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration， CFDA)指导原则及本实验室标准操作程序(standard operating procedures，SOP)的相关规定。

表3　11例甲氨蝶呤组患者血浆和脑脊液甲氨蝶呤浓度

ND：未测出

文献报道，无论何种给药方式，MPSS的药代动力学模型均为线性。血浆浓度达峰时间约30 min，脑脊液浓度约6 h达峰[2-10]。1个MPSS分子进入静脉后立刻水解为1个琥珀酸甲泼尼龙基团和1个钠离子，1个琥珀酸甲泼尼龙基团再继续分解为1个MP分子和1个琥珀酸基团，根据这一原理，计算MPS和MP浓度之和即可反映MPSS在体内的形式。CP血浆浓度达峰时间为30～60 min，脑脊液浓度达峰时间为50～60 min，脑脊液浓度约为血浆浓度的20%[11-14]。MTX口服方式下血浆浓度约1～2 h达峰，目前尚无文献报道MTX口服后脑脊液的达峰时间。有报道称在急性淋巴细胞白血病的患儿中，静脉大剂量使用MTX约100 min后脑脊液浓度达峰[15-17]。

本研究结果显示，MPSS穿透血脑屏障的比率为(0.52%±0.30%)，MTX穿透血脑屏障的比率为(0.18%±0.48%)，提示该两药穿透血脑屏障能力微弱，临床鞘内注射地塞米松和MTX为合理用药模式。CP穿透血脑屏障的比率为(22.74%±7.42%)，提示CP穿透能力相对较高，静脉用药也可在中枢神经系统局部发挥药效。

文献报道，多发性硬化患者静脉滴注1 500 mg MPSS 2 h后血浆浓度与脑脊液浓度之比为150，3 h后该比值为25，约6 h后药物在脑脊液中达峰值，浓度约为522 μg/L[18-21]。本研究按文献报道的峰值浓度时间取样，测得的脑脊液MPS+MP浓度为1.7～50.92 μg/L，远低于上文数据。辉瑞新西兰公司2012年版MPSS说明书提到，NPSLE患者MPSS脑脊液与血浆峰值浓度比值约为5%～6%；而本研究中MPSS脑脊液与血浆峰值浓度比为(0.52%±0.30%)，提示MPSS穿透血脑屏障比率低。MPSS为中等极性大分子，分子量为474.54，理论上其穿透血脑屏障的能力较弱，本研究结果与这一理论吻合。另外，血浆6 h与同期脑脊液MPS+MP浓度间存在线性关系，可以通过测量血浆浓度来估计同期脑脊液中的药物浓度，以合理用药，在保证治疗效果的同时，减少药物在局部不良反应。

CP为极性较小的中分子，相对分子质量为261 090，理论上其穿透血脑屏障的能力强于MPSS和MTX。本研究得到的CP脑脊液和血浆峰值浓度百分比与文献结果接近[22]。

MTX为极性分子，被动扩散吸收量较少，脑脊液中浓度更低，所以大部分患者在脑脊液中的浓度几乎检测不出来。本研究结果显示，口服MTX血脑屏障穿透率仅为(0.18%±0.48%)，其值很低，提示口服小剂量MTX不能透过或仅能轻微透过血脑屏障。Valesini等[23]于1994年首次报道了同治疗中枢白血病相似的鞘内治疗方法，认为MTX 10 mg和DXM 20 mg鞘内注射治疗神经精神狼疮可发生戏剧性的治疗效果，症状在24 h内得到控制。本研究结果也证实了在NPSLE的治疗中，MTX鞘内注射合理，毒性作用及不良反应小，同时能最大限度地提高疗效。

由于时间、技术有限，本研究未能全面地研究NPSLE患者血浆和脑脊液中MPSS、MTX和CP的药代动力学，试验设计中这3种药物在血浆和脑脊液中的达峰时间仅为根据文献总结而来。但不同个体药物在达峰时间、达峰浓度、代谢速率和药时曲线下面积等方面个体间差异仍很大，本次测量得到的峰值浓度可能存在误差，如果条件允许，可以连续地多时间点同时收集血浆和脑脊液，得到精确的血浆和脑脊液的峰值浓度，这样对比得到的药物穿透能力也更有说服力。若在同一个体上实施脑脊液多点采集有困难，可扩大样本量，将入组患者按时间点分组，不同时间点分组，再进行组间对比，浓度最高的亚组的采集点即可认定为脑脊液的达峰时间。另外，本研究收集的患者多采用联合用药模式，实验中不可避免地会产生不同药物间的相互影响，一种药物可能对另一种药物的分布、代谢和排泄产生协同或拮抗的作用。今后设计此类试验时，可完善入组标准，选择一段时间内只用一个药物治疗的患者，以排除药物间的相互影响。

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