细胞因子拮抗肽的制备、作用机制及应用研究进展

林 璐，叶 辉

(1温州医科大学第一临床学院，浙江温州325035;2温州医科大学基础医学院)

细胞因子是由机体免疫细胞、免疫原、丝裂原(或其他刺激剂)及某些非免疫性细胞诱导、合成并分泌的小相对分子质量的可溶性生物活性物质，大多为多肽类或者小分子糖蛋白，在正常机体内含量甚微，主要通过与靶细胞表面特异性受体结合发挥作用［1］。细胞因子既具有介导靶向细胞间信号传递、调节机体免疫应答、抗炎症效应、促进造血、抗病毒感染、抗肿瘤侵蚀等重要生物活性，也与引起休克、过度免疫性疾病、生理变态反应、器官移植排斥反应等病理过程密切相关［2～5］。采用激活或抑制细胞因子或其受体的方法可治疗细胞因子参与的疾病如类风湿关节炎(RA)、脑缺血损伤、多种癌症等［6～9］。传统的细胞因子抑制剂［10～13］主要包括天然黄酮类化合物、生物碱化合物以及木脂素、萜类等，其缺点是特异性不强、疗效差［14］，且缺乏激活效果。拮抗肽是新型的细胞因子抑制剂，主要用于治疗细胞因子分泌过多所致疾病，优点是可以特异性匹配不同的细胞因子。现将细胞因子拮抗肽的制备、作用机理及应用研究进展综述如下。

1 细胞因子拮抗肽的制备

拮抗肽的制备方法因其性质不同而异。对于许多天然拮抗肽，其分子构成并不重要，重点在于体外的人工合成(逆向合成技术使用等)或者构建新的表达体系;对于特定序列的肽链分子或其他小分子则可以利用已有的多肽文库进行细胞因子匹配筛选等。随计算机模拟技术的发展，目前对于拮抗肽的定向设计和理性改造渐趋丰富。

1.1 构建多肽文库进行特异性匹配筛选 利用小分子短肽模拟细胞因子或受体分子因具有合成简单、较易形成高浓度工作区、抗原性毒副作用少等优点，已用于许多细胞因子免疫性疾病中。构建一个小分子多肽文库就是在筛选合适拮抗肽的基础上，利用“钓饵”(细胞因子，受体蛋白，信号传递物质等)精确匹配出肽链序列以供后续合成。噬菌体肽库是最常用的多肽文库，即将编码小分子肽链的外源基因插入到丝状噬菌体基因Ⅲ(gⅢ)或Ⅶ(gⅦ)，以使目标肽链能以融合蛋白形式连接在噬菌体分泌的PⅢ或PⅧ的N端，进而展示在噬菌体颗粒表面，同时多肽的表达不干扰和影响噬菌体正常生活周期。2014 年 Yoshimoto等［15］与 Zheng 等［16］报道了以表皮生长因子(EGF)模拟肽的一级序列为基础，结合其生理功能替换13、15、16、41、43和47位氨基酸残基并将其诱变筛选构建突变噬菌体肽库，以靶细胞为“钓饵”匹配合成高亲和力的激动剂。也可用多个功能分子筛选目的片段以获得最佳效果，如血管内皮生长因子(VEGF)能与激酶受体结合诱导血管生成并介导肿瘤血管增生，因此对其激酶插入区受体(KDR)的阻断尤为重要。Binetruy-Tournaire等［17］分别用在细胞膜上表达的KDR和抗-VEGF的中和性单抗筛选噬菌体肽库，获得了拮抗性较高的短肽序列ATWLPPR，且顺利通过体外实验与动物实验。因此，对于小分子拮抗肽的肽库筛选可非常灵活的依照需求设计方案、分析功能并完成验证。另外，还有细菌表达肽库、核糖体肽库甚至化学合成肽库等也在研究领域中有较大的应用前景。

1.2 建模分析、理性设计 根据细胞因子或受体构象，模拟生理环境下的相互作用可以正确设计功能位点和辅助链，达到事半功倍的效果。如在TNF-α拮抗肽研究中，有学者基于鼠抗TNF-α中单抗Z-12能特异性识别TNF-α的141-146这一功能表位的特点，利用计算机理论模拟构建了TNF/抗体的复合生理反应模型，获得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7);利用人体抗体可变区重链框架(VHS)表达拮抗肽(PT2、PT3、PT4)设计了目标单抗，并合成了活性显著增加的单域抗体(PTVH5)。虚拟筛选库的应用减少了研究成本，也利于筛选出最优的匹配结构。在肝癌转移抑制拮抗肽的发展中，有研究者通过分子动力学模拟配体三维晶体结构，并运用分子对接与能量分析系统软件进行HAbl8G/CD147胞外区受体与对肝癌细胞转移有高效抑制功能的12肽配体对接，将成果顺序经过预打分排序、结合自由能函数经验性打分排序和结果的成簇处理等阶段，最终获得最优对接结构。通过对最优对接结构理论分析计算，得出受体和配体结合后复合物的结合区域与作用活性位点的详细相互作用，是今后高效拮抗肽研究发展的方向。

1.3 体外表达体系构建 在普通方法获得的目标产物数量不足以满足研究需求时，就需要运用合成生物学手段人工构建体外产物表达体系。另外，许多细胞因子在生物体内即有天然的拮抗剂或可溶性受体，此类拮抗肽可直接从机体分离获取，但技术繁琐、效率不高且花费较大。随基因工程标准化、模块化的发展，各种工程菌株以及分子生物学操作工具的完善，构建高效稳定的表达体系变得十分便捷。表达体系的构建通常是在前述两种手段的基础上进行的。如用于缓解强直性脊柱炎(AS)症状的拮抗肽基于阻断HLA-B27信号途径的治疗性基因疫苗［18］，研究人员在前期工作中使用 HLA-B*2704及HLA-B*2705重链胞外区蛋白筛选噬菌体12肽随机肽库并获得了能与其特异性结合的拮抗肽，然后针对HLA-B*2705-AP进行pcDNA3.1真核表达载体的构建及后续表达鉴定，构建了融合有增强型绿色荧光蛋白编码基因的 pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合CHO细胞表达载体和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合 CHO细胞表达载体，为深入研究和临床应用打下基础。此外，在B细胞活化因子(BAFF)拮抗肽研究中，研究人员在前期工作中先以跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)和BAFF的3D结构为基础设计目标拮抗肽，然后以pET-30a-BAFF1为基本表达载体，利用不同的内切酶和引物克隆获得一个高效的重组表达载体——pET-30a-BAFF2，在相同诱导表达和纯化条件下获得可溶性的BAFF1、BAFF2蛋白，并在体外亲和性测试中获得较好效果。体外表达体系构建的另一个重要作用就是为拮抗肽的大规模生产提供可能，即利用微生物生长周期短、繁殖迅速的特点提高产量、降低成本，而如何保持重组体系的高效稳定则是需要迫切解决的问题。

2 细胞因子拮抗肽的作用机理

2.1 拮抗肽与靶细胞表面受体特异性结合 拮抗肽发挥功能的关键主要在于其特殊的肽链及高级空间结构，可通过促进拮抗肽与靶细胞的受体特异性结合而竞争性或非竞争性抑制细胞因子与受体的结合。研究者将多肽类抗肿瘤扩散抑制剂与细胞表面的整合素、层粘连蛋白(LN)和纤维粘连蛋白(FN)的结合位点结合，通过饱和上述位点可抑制细胞因子所致肿瘤黏附、浸润和转移(RGD短肽)，抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞并降低肿瘤细胞的侵袭能力(GRGDS短肽)。设计合成拮抗肽过程中，其与受体细胞的亲和能力是最重要的因素。钱钰等［19］认为，TNF拮抗治疗中细胞因子介导的信号通路涉及物理作用、磷酸化、泛素化、酶复合作用等多个过程，构建拮抗肽时需要选择特定的化学基团(氨基酸基团、残基)提高与靶向目标(可以是中间信号分子)的亲和能力、更好的阻断信号通路。在噬菌体肽库的短肽链筛选上，也需要从靶细胞出发选择结合性能最好的拮抗肽。

2.2 拮抗肽模拟受体元件与细胞因子结合 除与细胞受体特异性结合外，部分小分子拮抗肽尚可模拟细胞靶受体的功能元件与细胞因子结合进而阻止细胞因子与靶受体的结合，抑制相应信号通路的传递。Gevaert等［20］研究发现，IL-5的某种拮抗肽具有与其相似的二硫键交联结构，可模拟结合位点而阻断原信号通路。Bourboulia等［21］发现，CD147拮抗肽(HAb18G等)可在高位阻断细胞因子的分泌进而抑制其促基质金属蛋白酶(MMPs)生成作用，最终抑制肿瘤扩散。陈丽娜等发现，在细胞内有一种TNF的天然小分子模拟肽拮抗剂，其产生于跨膜运输后的酶切脱落或mRNA剪切异常，可作为负调节因子将细胞因子转运至各种组织细胞释放(或者延缓释放)，从而阻断细胞因子与细胞靶受体的结合，抑制信号通路的发生。此类拮抗肽的特点为天然无抗原性、无排异性。

2.3 大分子拮抗肽的抑制作用 钱钰等［19］发现，某些大分子拮抗肽可通过氨基酸残基的直接酸碱中和作用或底物磷酸化某些信号分子等宏观反应抑制细胞因子。王聪等［22］研究表明，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的拮抗肽P7与bFGF结合后，bFGF激活的促增殖信号分子磷酸化水平降低、细胞增殖作用受抑。此类拮抗肽相对分子质量较大，关键结构是一些有快速反应能力的氨基酸残基或其功能基团，可通过分离机体组织液获取。Gautier等［23］通过核磁共振(NMR)和细胞试验发现，VEGF的拮抗肽化合物能抑制VEGF165诱导的VEGFR-1磷酸化，有望作为新的抗血管生成剂用于临床。

拮抗肽的作用机理与肽链的一级乃至二、三、四级空间结构密切相关。选择合适的靶点目标及利用结构解析深化作用机理研究相互构效的关系，有望实现功能肽链的不断改进。

3 细胞因子拮抗肽在临床上的应用

3.1 TNF-α拮抗肽 TNF-α是细菌性脓毒血症病理机制中的关键介质，其过量表达在RA、感染性休克及其他多种炎症反应过程中均具有损伤性、甚至致死性。早期研究［24］显示，细胞因子在RA发病中具有一定作用，且患者关节滑液中可检测到IL-1、TNF、IL-6、IL-2、粒细胞集落刺激生物因子(GMCSF)等主要炎性细胞因子。另有学者［25，26］报道，利用匹配筛选出的高亲和力特异性单克隆抗体可以较好的中和人TNF等因子(包括A2抗体、降低免疫原性后的cA2嵌合型抗体)，从而较好的控制TNF异常表达诱发的疾病。欧洲四个地区的双盲、随机、安慰剂对照试验显示，应用1、10 mg/kg的cA2后两组有效率分别为44%、79%，之后的二期临床进一步筛选了用量及周期［24］。

3.2 IL拮抗肽 IL-1α、IL-β 都属于重要的 IL，在炎症反应中起调节剂的作用，其大量产生会引起下列内分泌效应:诱导肝脏急性期蛋白合成;引起发热和恶病质。通常机体能够通过自身分泌受体拮抗肽IL-1ra调节IL-1r的结合通量和活性。Akeson等［27］利用人工重组可溶性IL-1受体筛选15肽噬菌体肽库，得到的特异性短肽链活性接近天然IL-1ra;进一步设计构建得到15肽链AF12198，在机体内外均可抑制多种IL-1诱导的生物学活性。IL-5通常由抗原活化的CD+4T细胞产生，主要功能是刺激嗜酸性粒细胞增殖、分化及活化。在过敏性疾病和蠕虫感染时机体出现的嗜酸性粒细胞骤增也主要经由IL-5引起，特别是人类体内的IL-5还能刺激嗜碱性粒细胞释放白三烯和组胺等炎症介质，提高嗜碱性粒细胞的生理活性。England等［28］进行随机肽库筛选时发现，将人体IL-5 Ra胞外区(ECD)作为靶点可以匹配到两种能与之特异性结合的小分子肽，其后创立变构肽库时通过亲和性筛选获得具有拮抗IL-5功能的19肽AF18748，而嗜酸粒细胞黏附试验显示目标肽链可高效拮抗IL-5的生理活性。

3.3 BAFF拮抗肽 BAFF属于肿瘤坏死因子配体超家族(TNSF)，其功能主要是刺激B细胞增殖、分化和成熟并维持其生理活性，在体液免疫应答过程中具有不可替代的作用。正常机体环境中，TACI、B细胞成熟抗原(BCMA)、BR3三个自身受体可与BAFF特异性结合，进而调节B细胞生理活性并维持机体免疫应答平衡。BAFF分泌不足会引起机体免疫功能紊乱、低下，造成免疫缺陷类疾病;BAFF表达过度则会诱发B细胞的恶性增殖、引起B细胞介导的自身免疫反应性疾病如RA、干燥综合征(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)和 B淋巴细胞瘤等［29］。Kayagaki等［30］研究表明，以 BR3 和 BCMA为基本构象的拮抗肽可高效抑制BAFF的生理功能，而利用BAFF及短肽链的3D结构分析可以定向设计、构建具有拮抗功能的拮抗肽，并可通过体外实验验证其用于临床治疗的可行性。研究者在TACI关键氨基酸残基的基础上自行设计并合成得到两种拮抗肽TA和TC，其抑制率随肽浓度增大而显著增高，拮抗肽质量浓度为100 μg/mL时对目标BAFF的抑制率分别达31%和51%，有着良好应用前景。

3.4 症状缓解类拮抗肽 部分免疫类疾病致病机理复杂，但引发症状较严重。如强直性脊柱炎(AS)发病早期隐匿性高、致病过程长，最终导致患者正常活动能力丧失。能高效、低毒迅速缓解AS的症状，又能选择性有效阻断AS病理过程的治疗方法是目前所推崇的。Santos等［31］研究表明，HLA-B27是AS发病免疫过程的中心环节;有学者将HLA-B*2704及HLA-B*2705重链胞外区蛋白作为钓饵筛选噬菌体12肽随机肽库，获得了能与其特异性结合的小分子拮抗肽，以此为基础加工构建了具有治疗功效的拮抗肽分子，并在体外功能鉴定中获得较好效果。

以上几种是较为典型的细胞因子拮抗肽在临床医疗或实验阶段的应用，都表现出高效、特异的优点，随着拮抗肽作用机理研究的深化以及拮抗肽合成方式的优化，这种治疗方法有望得到更大规模的推广。

细胞因子造成的免疫类疾病长期以来给人们的健康造成了非常大的危害，而拮抗肽是可以特异性治疗此类疾病的药物，对其功效以及机理的研究有着非常大的实用价值。目前已经研发了可有效控制RA、癌细胞扩散及AS的多种拮抗肽类制剂，对其机理的研究也已经从功能作用深入到分子结构及空间构效上，故其扩大应用的前景十分可观。今后的研究需要掌握拮抗肽对机体稳态系统的影响，在分子水平更深入解析不同部位的作用及整体构象的影响，在合成方法和工艺上需要从天然获取角度开发新的思路。

［1］Bashashati M，Rezaei N，Bashashati H，et al.Cytokine gene polymorphisms are associated with irritable bowel syndrome:a systematic review and meta-analysis［J］.Neurogastroenterol Motil ，2012，24(12):1102.

［2］Bak RO，Mikkelsen JG.Regulation of cytokines by small RNAs during skin inflammation［J］.J Biomed Sci，2010，17(1):1-19.

［3］Dinarello CA.Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family［J］.Annu Rev Immunol，2009，27:519-550.

［4］Mortazavi H，Esmaili N，Khezri S，et al.The effect of conventional immunosuppressive therapy on cytokine serum levels in pemphigus vulgaris patients［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2014，13(3):174-183.

［5］Orelio C，Peeters M，Haak E，et al.Interleukin-1 regulates hematopoietic progenitor and stem cells in the midgestation mouse fetal liver［J］.Haematologica，2009，94(4):462-469.

［6］Assier E，Semerano L，Duvallet E，et al.Modulation of anti-tumor necrosis factor alpha(TNF-α)antibody secretion in mice immunized with TNF-α kinoid［J］.Clin Vaccine Immunol，2012，19(5):699-703.

［7］Prevosto C，Goodall JC，Gaston JS.Cytokine secretion by pathogen recognition receptor-stimulated dendritic cells in rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis［J］.J Rheumatol，2012，39(10):1918-1928.

［8］Famakin B，Mou Y，Spatz M，et al.Downstream Toll-like receptor signaling mediates adaptor-specific cytokine expression following focal cerebral ischemia［J］.J Neuroinflammation，2012，9(1):174.

［9］Rostami S，Aslim B，Aytac Z.Anti-carcinogenic and inhibitory effects on cytokine secretion of Veronica lycica E.Lehm.in human colon cancer cell line［J］.Planta Med，2012，78(11):338.

［10］张英华，于亮亮，朱若男，等.天然产物促炎性细胞因子拮抗剂研究进展［J］.中国药房，2010，(31):2956-2958.

［11］Gerritsen ME，Carley WW，Ranges GE，et al.Flavonoids inhibit cytokine-induced endothelial cell adhesion protein gene expression［J］.Am J Pathol，1995，147(2):278.

［12］Sharma V，Lansdell TA，Jin G，et al.Inhibition of cytokine production by hymenialdisine derivatives［J］.J Med Chem，2004，47(14):3700-3703.

［13］Cho MK，Jang YP，Kim YC，et al.Arctigenin，a phenylpropanoid dibenzylbutyrolactone lignan，inhibits MAP kinases and AP-1 activation via potent MKK inhibition:the role in TNF-α inhibition［J］.Int Immunopharmacol，2004，4(10):1419-1429.

［14］Zhao F，Wang L，Liu K，et al.In vitro anti-inflammatory effects of arctigenin，a lignan from Arctium lappa L.，through inhibition on iNOS pathway［J］.J Ethnopharmacol，2009，122(3):457.

［15］Yoshimoto N，Tatematsu K，Iijima M，et al.High-throughput de novo screening of receptor agonists with an automated single-cell analysis and isolation system［J］.Sci Rep，2014，28(4):4242.

［16］Zheng Y，Zhang C，Croucher DR，et al.Temporal regulation of EGF signalling networks by the scaffold protein Shc1［J］.Nature，2013，499(7457):166-171.

［17］Binétruy-Tournaire R，Demangel C，Malavaud B，et al.Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor(VEGF)-mediated angiogenesis［J］.EMBO J，2000，19(7):1525-1533.

［18］Evans DM，Spencer CCA，Pointon JJ，et al.Interaction between ERAP1 and HLA-B27 in ankylosing spondylitis implicates peptide handling in the mechanism for HLA-B27 in disease susceptibility［J］.Nat Genet，2011，43(8):761-767.

［19］钱钰，周建平，高鹏，等.肿瘤坏死因子抑制剂的研究进展［J］.现代药物与临床，2012，27(2):143-149.

［20］Gevaert P，Van Bruaene N，Cattaert T，et al.Mepolizumab，a humanized anti-IL-5 mAb，as a treatment option for severe nasal polyposis［J］.J Allergy Clin Immunol，2011，128(5):989-995.

［21］ Bourboulia D，Stetler-Stevenson WG.Matrix metalloproteinases(MMPs)and tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMPs):positive and negative regulators in tumor cell adhesion［J］.Semin Cancer Bio，2010，20(3):161-168.

［22］王聪，林绍强，李校堃，等.P7抑制bFGF诱导的3T3细胞增殖的作用机制［J］.药学学报，2010，45(3):314-317.

［23］Gautier B，Miteva MA，Goncalves V，et al.Targeting the proangiogenic VEGF-VEGFR protein-protein interface with drug-like compounds by in silico and in vitro screening［J］.Chem Biol，2011，18(12):1631-1639.

［24］刘耀文.细胞因子及其相关靶点的治疗进展［J］.国外医学:药学分册，2005，32(1):36-38.

［25］ Kim SS，Ye C，Kumar P，et al.Targeted delivery of siRNA to macrophages for anti-inflammatory treatment［J］.Mol Ther，2010，18(5):993-1001.

［26］侯青顺，仉海峰，闫秀萍，等.慢性乙型肝炎病毒感染者血清TNF-α和IFN-γ 水平分析［J］.中国医药导报，2010，7(30):69-70.

［27］Akeson AL，Woods CW，Hsieh LC，et al.AF12198，a novel low molecular weight antagonist，selectively binds the human type I interleukin(IL)-1 receptor and blocks in vivo responses to IL-1［J］.J Biol Chem，1996，271(48):30517-30523.

［28］England BP，Balasubramanian P，Uings I，et al.A potent dimeric peptide antagonist of interleukin-5 that binds two interleukin-5 receptor α chains［J］.Proc Natl Acad Sci，2000，97(12):6862-6867.

［29］Reddy V，Garcia GM，Isenberg D，et al.Changes in the relationship between BAFF，BAFF-R and B cell phenotype following rituximab in patients with systemic lupus erythematosus［J］.Ann Rheum Dis，2014，73(Suppl 1):A81.

［30］Kayagaki N，Yan MH，Seshasayee D，et al.BAFF/BLyS receptor 3 binds the Bcell survival factor BAFF ligand through a discrete surface loop and promotesprocessing of NF-κB2［J］.Immunity，2002，17(4):515-524.

［31］Santos SG，Lynch S，Campbell EC，et al.Induction of HLA-B27 heavy chain homodimer formation after activation in dendritic cells［J］.Arthritis Res Ther，2008，10(4):1-7.