非小细胞肺癌组织中EGFR、HER-2蛋白的表达变化及意义

李宗军，沈 毅，唐东方，金翔凤，王耀鹏，矫文捷，隋爱华，刘玉洪

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

肺癌是世界上病死率最高的恶性肿瘤之一，其中约85%是非小细胞肺癌(NSCLC)［1］，5年生存率仅为20%～25%，死亡原因主要是肿瘤的局部侵袭及远处转移。表皮生长因子受体(EGFR)是癌基因C-erbB-2产物的同源物，具有酪氨酸激酶的活性，其异常表达与肿瘤细胞的黏附、侵袭、转移及凋亡抑制有关［2］;人类表皮生长因子受体2(HER-2)基因是重要的癌基因之一，其高表达与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和血管生成有关［3］。NSCLC组织中EGFR、HER-2蛋白表达的联合检测国内少见报道。本研究利用免疫组化方法检测了EGFR、HER-2蛋白在NSCLC组织中的表达，分析了两者间及与肿瘤临床病理特征的关系，旨在为NSCLC的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 青岛大学医学院附属医院胸外科2011年10月～2012年10月收治的的NSCLC患者68例，男42例，女26例;年龄42～78岁(中位年龄62岁)，其中＜60岁35例、≥60岁33例;有吸烟史39例。均经病理检查确诊，其中腺癌48例，鳞癌20例;低分化27例，中高分化41例;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期28例;有淋巴结转移37例。患者术前均未接受过化疗、放疗及免疫治疗。留取手术切除的肿瘤组织68份及癌旁正常肺组织(无癌细胞浸润，距肿瘤病变＞5 cm)20份，10%甲醛中性缓冲液固定、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 试剂 鼠抗人 EGFR单克隆抗体、鼠抗人HER-2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司，其余试剂为国产分析纯。

1.3 EGFR及HER-2蛋白的检测方法 取上述石蜡切片，行常规HE染色及免疫组化SP染色。①脱蜡水化:60℃烤片1 h，二甲苯脱蜡2次、每次5 min，依次浸入梯度乙醇和蒸馏水中各5 min水化。②抗原修复:将pH值为6.0的0.01 mol/L柠檬酸缓冲溶液加入高压锅内，修复切片完全浸于修复液中后盖上压力锅盖，加热至均匀喷气，1～2 min后压力锅离开热源，自然冷却至室温，取出切片，蒸馏水淋洗，PBS漂洗2次、每次3 min。③封闭、染色:滴加试剂1(内源性过氧化物酶封闭液)，室温孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加试剂2(封闭用正常羊血清工作液)，室温孵育10 min，甩干。分别滴加EGFR、HER-2一抗工作液(1∶100、1∶50)，室温孵育 1 h，PBS 充分淋洗。滴加试剂3(生物素标记羊抗鼠二抗工作液)，室温孵育10 min，PBS充分淋洗;滴加试剂4(HRP标记的链霉亲和素)，室温孵育10 min，PBS充分淋洗。滴加DAB显色工作液显色，显色时间1～5 min，显微镜下观察达最佳显色效果后自来水冲洗;甩去自来水，滴加适量改良型苏木素以覆盖整个组织，复染30 s～3 min，自来水冲洗复染液，PBS或去离子水浸泡切片3～5 min，使胞核反蓝;脱水、透明、封片、镜检。EGFR表达以细胞质和细胞膜呈棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，HER-2表达以细胞膜呈棕褐色颗粒状为阳性。着色强度判定标准:不着色为0分(阴性)，轻度着色为1分(弱阳性)，中度着色为2分(阳性)，强着色为3分(强阳性);阳性细胞率(计数10个高倍镜视野)判定标准:＜5%为0分，5%～30%为1分，31%～70%为2分，＞70%为3分。两积分相乘之积≥1判为表达阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理和分析。率的比较采用 χ2检验;EGFR、HER-2蛋白表达及与肿瘤临床病理参数的相关性采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、HER-2蛋白表达及与 NSCLC临床病理参数的关系 NSCLC组织及癌旁组织中EGFR蛋白阳性表达者分别为37例(54.4%)、0例，HER-2蛋白阳性表达者分别为45例(66.1%)、0例，阳性率两两比较，P 均 ＜0.05(χ2分别为 18.78、27.08)。EGFR蛋白表达与NSCLC病理类型及有无淋巴结转移有关，P 均 ＜0.05(χ2分别为 9.88、14.80);与NSCLC分化程度、TNM分期及患者年龄、性别、吸烟情况无明显相关(P均 ＞0.05)。HER-2蛋白表达与NSCLC的TNM分期及有无淋巴结转移有关，P 均 ＜0.05(χ2分别为 8.12、8.06);与NSCLC分化程度、病理类型及患者年龄、性别、吸烟情况无明显相关(P均＞0.05)。详见表1。

表1 EGFR、HER-2蛋白表达与NSCLC临床病理参数的关系

2.2 EGFR与HER-2蛋白在NSCLC组织中表达的相关性 68例NSCLC组织中EGFR、HER-2蛋白均阳性表达32例、均阴性表达18例，EGFR蛋白阳性表达而HER-2蛋白阴性表达5例、EGFR蛋白阴性表达而HER-2蛋白阳性表达13例。EGFR、HER-2 蛋白的表达呈正相关，r为1.0(P ＜0.05)。

3 讨论

近年来，我国NSCLC的发病率和病死率均有升高趋势，治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、分子靶向治疗等。其中针对NSCLC患者EGFR基因表达的分子靶向治疗药物(EGFR-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼显示了空前的优越性，多项研究证实对于EGFR突变阳性患者可予EGFR-TKI作为一线治疗［4］。靶向药物拉帕替尼是一种可逆性EGFR和HER-2双受体阻断剂，临床试验证明其对多种实体肿瘤有明显的抑制作用［5］。因此，EGFR和HER-2作为分子靶标在 NSCLC治疗中的作用日渐突出。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性的膜受体，能与相应配体如表皮生长因子(EGF)及TGF-α结合形成二聚体，激活酪氨酸激酶活性，使自身酪氨酸残基发生磷酸化，并能与下游含PTB和SH2区域的蛋白结合激发激酶级联反应，进而激活细胞信号传导通路，调节并促进细胞分化、生长、迁移、黏附等。EGFR不但具有调节正常细胞增殖分化的作用，还是肿瘤细胞增殖、分化和抗凋亡过程中的重要调节因子，其异常表达可促进肿瘤细胞增殖、黏附、侵袭、转移及诱导肿瘤新生血管形成［6，7］，与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，且在30%～70%的NSCLC组织中过表达，尤其是非吸烟、女性、肺腺癌患者［8］。本研究显示，EGFR蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且与NSCLC病理类型及淋巴结转移情况有关。证实EGFR与NSCLC的发生、转移有关。但本研究未发现EGFR蛋白表达与NSCLC分化程度、TNM分期及患者年龄、性别、吸烟情况有关，可能与样本量小有关。HER-2癌基因与EGFR同属于表皮生长因子家族，所编码的跨膜糖蛋白是一种具有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，能与相应配体结合后形成同源性二聚体或异源性二聚体，并通过激活细胞内的酪氨酸磷酸化参与细胞的信号传递过程，信号在细胞内通过激酶级联反应最终介导和调节细胞的生长、分化、增殖和黏附。正常情况下，HER-2原癌基因能与其他表皮生长因子受体结合，通过复杂的信号传递调节细胞的生长和分化;受到某些致癌因素的作用后，HER-2的蛋白结构或表达调控失常，可促使细胞发生恶性转化，并通过阻止肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤新血管生成等途径促进肿瘤细胞的生长、浸润及转移［9，10］。研究［11］表明，HER-2 在人类许多肿瘤组织中有异常表达，与肿瘤细胞分化、增殖、转移、侵袭等过程密切相关，而且还使细胞的恶性度增加。本研究结果显示，HER-2蛋白在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，且与NSCLC的TNM分期及淋巴结转移情况有关。证实HER-2蛋白高表达与NSCLC的浸润转移及进展密切相关，有望成为评价肺癌转移和判断肿瘤进展的重要分子生物学指标之一。

EGFR参与正常的细胞生长、分化和修复，在无活性状态下以每个HER单体的形式存在，与相应配体结合后促使其形成同源二聚体或异源二聚体。许多肿瘤发生与EGFR突变、过表达等导致的受体激活有关。EGFR和HER-2是生长因子家族中最活跃、最受瞩目的受体，也是NSCLC组织中的主要合作受体，原因可能为激活的含有HER-2的异源二聚体复合物比含有其他HER家族成员的复合物在细胞表面更稳定、更具侵袭力［12］。Pidaparthi［13］采用多元分析技术发现，肺癌组织中EGFR/EGFR和EGFR/HER-2是最常见的二聚体形式。HER-2具有增强配体诱导的受体激活、增加并延长信号传导通路、增强配体与受体的亲和力、减少配体自同族的HER成员中分离的作用，且EGFR/HER-2与同源二聚体比较有更强的增殖、侵袭、转移作用［14］。本研究显示，NSCLC组织中EGFR、HER-2蛋白表达呈正相关。推测两蛋白可能通过形成EGFR/HER-2异源二聚体参与NSCLC的发生和发展，且二者之间的相互作用具有导致肿瘤浸润转移的倾向。由于本研究的病例数量有限，且检测方法、操作程序及评分标准有不足之处，上述结论尚有待于进一步研究证实。

综上所述，EGFR、HER-2蛋白在NSCLC组织中呈高表达，两者可能协同参与肿瘤发生、发展、侵袭及转移。

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