乙型肝炎病毒基因突变与临床疾病进展的关系*

李 梵 综述，陈国凤，徐东平 审校

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个全球公共卫生问题。HBV感染人体后可以引起急性肝损伤和慢性病毒感染。慢性HBV感染者疾病的临床转归包括：慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌以及肝衰竭。宿主、病毒因素[1]、环境、药物、酒精等因素与慢性HBV感染的进程相关。在诸多因素中，HBV基因突变是影响病毒生物学特性的基本因素。因HBV聚合酶无校对功能，病毒在复制过程中容易产生变异。循环中变异病毒数量巨大，突变在一定范围内累积，使得在感染者体内HBV是以准种形式存在，在环境选择压力下，准种的病毒组合不断变化，引起病毒生物学特点的变化。突变随着HBV感染时间的延长而逐步累积，不同疾病阶段突变率有显著差别。以下将可能与临床疾病进展相关的各个HBV基因区突变做一综述。

1 C基因区突变

前 C区 （nt 1814-1901）参与编码 HBV E抗原（HBeAg），由29个氨基酸组成。最常见的突变是HBV前C区G1896A突变，HBeAg的合成终止，但HBV核心抗原（HBcAg）的正常翻译却未受影响。HBeAg是小分子可溶性蛋白，可以缓解细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）对细胞膜上HBcAg的攻击，导致HBV感染的肝细胞无法被清除[2]，如果HBeAg合成或分泌障碍，CTL容易攻击感染肝细胞，造成肝细胞损伤。G1896A突变还增加HBV nt1847-1917茎环结构的稳定性，上调HBcAg的表达；HBcAg由核型转为胞浆型，增加了其对肝细胞的毒性。

核心启动子区（core promoter，CP）（nt1643-1849）是直接引发前基因组RNA转录的启动子，包括基本核心启动子区（basic core promoter，BCP）（nt1742-1849）和其上游调节元件。CP区能够调节前核心RNA(precoreRNA)转录、HBeAg产量以及影响病毒前基因组（pregenome RNA，pgRNA）的复制和HBcAg的表达。

BCP区是研究的热点。目前，常见T1753A/C、T1754C/G、A 1762T、G 1764A、C1766T等突变形式，其中以1762/1764双联突变最为常见，联合突变可以上调pgRNA的转录，促进pgRNA衣壳化，增加HBcAg产量，从而增强HBV复制力。细胞转染实验显示，联合突变可以抑制precoreRNA的转录，继而降低HBeAg合成。多联突变的影响高于双联突变，例如1762/1764双联突变病毒复制力和HBeAg合成量分别是野生株的2倍和80%，而1753/1762/1764三联突变分别是4倍和70%，1753/1762/1764/1766四联突变则达到了8倍和20%[3]。另外，BCP区基因突变还可以增加肝细胞凋亡[4]。

C区（1901-2452）有500多个核苷酸，表达的HBcAg是CTL攻击的靶抗原，可导致表达靶抗原的感染肝细胞死亡，C基因突变可引起HBcAg抗原表位发生改变，从而直接影响到宿主对HBV的免疫应答。例如，Sugiyama等的研究认为，A2339G变异会在体外增强HBV复制，发生此变异的患儿ALT峰值较没有该变异的患儿高[5]。

由于上述可能的机制，许多研究发现随着乙肝病情严重程度的增加，前C/BCP区突变检出率随之增高。例如：前C区1896位突变和1762/1764双联突变更多见于HBeAg阴性和疾病进展程度更高的患者；同时不论基因B型还是C型，1762/1764双联突变都会加速疾病的进展和增加肝癌的发生机率[6-9]。

一项多中心研究对250例慢性HBV（基因B或C型）患者1762/1764双联突变率进行了分析，结果提示随着疾病严重程度增加，1762/1764双联突变率也相应增加；而且该双突变阳性率在肝癌患者中显著增高，是HBV携带者发生肝癌的病毒学预测因素[6]。另一研究得出相似的结果，该研究对400例HBV携带者进行长期纵向随访，发现1762/1764双联突变是疾病进展和发生肝癌的独立预测因素[10]。另外，先前Meta分析表明从无症状携带者到肝硬化，C1653T、T1753V及1762/1764双联突变检出率逐渐增加，CP区其他位点突变也与肝癌发生风险性的增加密切相关[11]，且CP区其他位点突变大部分发现始终与1762/1764双联突变相伴随，提示1762/1764双联突变在肝癌发生中可能具有重要作用。纵向的研究表明1762/1764双联突变在诊断肝癌之前很多年就发生，而其他位点突变在临近诊断肝癌时发生，说明1762/1764双联突变在肝癌早期阶段发生具有作用，而CP区其他位点突变在促进肝癌发生也有作用的[12]。Yin等完成的一项大样本横断面（846名无症状携带者、235名慢性肝炎、188名肝硬化患者、190名肝癌）研究[13]提示：在HBV基因C型感染的患者中，肝硬化患者 HBV C1673T、A1726C、A1727T、C1730G、C1766T、T1768A、C1773T、C1799G 的 突 变率明显高于慢性乙型肝炎患者，肝癌患者上述位点突变率高于肝硬化，逐步多因素回归分析提示HBV基因C型、患者年龄、性别、转氨酶水平，及T1768A、A1762T/G1764A和A1846T突变与肝硬化的发病独立相关；肝癌发生的独立预测因素有患者年龄、异常转氨酶、HBVD NA≥104IU/ml、基因C型以及C1653T、T1674C/G、T1753V和A1762T/G1764A突变。除了T1674 C/G以外，这些发现和Meta分析的结论[11]一致。在该项研究中，即使平衡年龄因素的影响，CP区变异仍与肝癌的发生密切相关。我们之前大样本量的研究也表明，前C/BCP区基因突变与疾病的严重程度密切相关[14]。

2 S基因区突变

S基因包括前 S1区（nt2848-3204），前 S2区（nt3205-0154），S区（nt155-835）。分别编码 119个氨基酸（amino acid，aa）残基的前S1蛋白、55个aa的前S2蛋白和226个aa的S蛋白。

前S区位于S基因的5’端，分为前S1区和前S2区。前S1区包涵有119个氨基酸，分为2个部分，N端（aa1-57）和C端（aa58-119）；前S2区包含55个氨基酸。前S区具有T细胞和B细胞的识别位点，因此易影响免疫反应[8，15，16]。前S区含有在病毒生活周期中起关键作用的结构位点[8]，如：肝细胞结合区域（位于前S1域的N端，对感染至关重要）、热休克蛋白70-结合位点（位于前S1域的C端）、细胞溶质停留决定子（cytosolic anchorage determinant，CAD、位于前 S1域的 C端）、核衣壳结合位点（位于前S1域的C端）、CCAAT结合因子（CCAAT-binding factor，CBF）结合位点（位于前 S1域的 C端，对S基因表达必需的）、多聚人血清白蛋白（polymerized human serum albumin，pHSA）结合位点、S启动子（位于前S1域的C端）等。研究证实，前S1/前S2区为HBV变异最大的区域，最容易发生缺失突变。前S区突变位置通常包括在：前S1的3’端缺失和前S2的5’端缺失、前S2的起始密码子缺失，以及前S2的起始密码子的点突变等。

前S区突变可能改变病毒的感染性及分泌能力，改变病毒的抗原性及结合位点识别能力，从而影响疾病的发生、发展过程。前S1和前S2突变通常使得大蛋白、中蛋白、小蛋白比例失调，大蛋白在肝细胞内质网（endoplasmic reticulum，ER）上过量产生和滞留，增加了ER压力，导致DNA损伤以及基因组不稳定性[17]，造成肝细胞进一步损伤及肝癌的发生。另外，前S2基因的表达与肿瘤抑制基因p53的表达高度相关[17]，截短了的前S2片段在整合进入宿主基因组时仍具有转录交易能力可能是致癌的机制之一[18]，前S2突变诱导周期蛋白依赖性激酶抑制剂的分解，使得细胞周期不受控制进展[19]也是可能致癌的机制之一。Mun等选取241例不同程度的韩国HBV感染者进行分析，结果提示HBV F141L与肝癌密切相关。通过稳定细胞系研究，发现F141L-LHBs可以通过下调p53和P21、上调CDK4和细胞周期蛋白A使得细胞周期进展[20]。前S2基因缺失可形成毛玻璃样肝细胞（ground glass hepatocytes，GGHs）类型[18]，与肝病进展到更严重的阶段如肝硬化有关。

S区基因在某些药物如免疫抑制剂、核苷类抗病毒药物等诱导下，容易发生突变。S区基因a决定簇突变是病毒逃避表现抗原免疫的主要原因，这种形式突变常见于出生时应用了乙肝疫苗和免疫球蛋白免疫但却感染HBV的婴儿，后来在肝移植患者也发现。目前报道较多的有sG145R，其他位点也可见变异，但其临床意义有待进一步研究。

前S基因缺失突变多见于基因C型，病情严重程度较无前S缺失的患者严重，且随着肝脏疾病严重程度的增加，突变率相应增加。因此在较晚的疾病阶段患者中前S区缺失检出率更高。前S区缺失突变也与肝癌的发生密切相关。Lin等[21]检测了266名慢性HBV感染患者，包括202例无症状携带者、64名肝癌患者，总体上前S缺失率为16.5%，肝癌和基因C型者更易发生前S基因的缺失突变。年轻的肝癌患者前S缺失发生率更高。香港大学Yeung等[22]分析69名慢性乙肝患者和115名肝癌患者后发现，前S缺失检出率为21.9%，规模从3-189bp，集中在前S1的3’端和前S2的 5’端，可见前S1启动子、前S2启动子区域缺失突变。人血清白蛋白受体区及S启动子区缺失较为多见，而肝细胞结合位点及CCAAT盒子缺失较为少见。前S2缺失突变是肝癌发生的独立预测因素，小于50岁的肝癌患者前S缺失率更高。刘世建等进行功能位点分析后前S缺失类型主要以PreS2的 N端缺失和突变最为多见，占缺失突变62.5%，较前S1的更为多见。功能位点分析主要见于病毒分泌、核苷酸结合位点、转录和pHSA结合位点。

前S1涵盖了对病毒生活周期相关的位点，如肝细胞结合位点，S启动子区域，而前S2涵盖大量的T细胞及B细胞表位，对免疫压力的反应更活跃。前S1和前S2区缺失可以导致不同的GGHs组织病理类型[23]，与前S1相比,前S2缺失具有导致更高的ER压力能力，通过DNA损伤,更完全的导致肝癌[23]，提示前S1和前S2缺失引起疾病进展的模式可能不同，因此在针对韩国病人的研究中，前S1缺失比前S2缺失与肝癌更相关，Mun[24]研究检测了120名乙肝不同疾病程度的患者，发现总体前S缺失率为30.8%，前S缺失随着临床疾病程度增加逐步增加，但是发现前S1启动子缺失在肝癌患者中比率明显增高，约22.5%。前S1缺失在肝癌患者中较肝硬化检出率更高，前S2缺失在肝硬化患者中检出率高于肝癌，另外韩国数篇相关文章研究也认为肝癌发生与前S1缺失更相关[25，26]。推测其主要原因可能是韩国的研究对象几乎大部分感染基因C型。Yin[27]等的研究验证了上述结论，前S2突变和慢性肝病进展相关，前S1突变和肝癌发病相关。与慢性肝病相比，81%的前S1突变在基因C型中与肝硬化负相关，多因素回归分析表明C2964A、C3116T和C7A是肝癌发病的独立预测因素，同时A2964C和C3116T是与发生肝硬化风险相关的标记。

3 P基因区突变

P基因区（nt2307-0-1623）共涉及4个功能区：末端蛋白区、间隔区、多聚酶（polymerase，POL）/逆转录酶（reversetranscriptase，RT）区，核糖核酸酶H区。RT基因是P基因的重要组成部分，包括 7 个功能亚区：A、B、C、D、E、F、G 亚区。RT区突变意义体现在两个方面：一是该区是抗HBV核苷（酸）类似物的作用靶位，病毒产生耐药突变后可引起病毒反跳，不合理停药可导致野生病毒复制迅速增加，诱导过度免疫反应，引起病情加重，疾病进展。目前常用药物有拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦。拉米夫定最常见的耐药形式是 rtM204Ⅰ和 rtM204V，rtL80Ⅰ、rtV173L、rtL180M 为其补偿突变。我们的研究也发现rtL229F可继发于rtM204I变异，虽然不能直接降低病毒对药物的敏感性，但可补偿rtM204I复制力的降低，也是一种补偿突变[28]。替比夫定与其分子及结构和作用目标位点相似，存在交叉耐药，rtN236T、rtA181V是阿德福韦酯常见的耐药形式。恩替卡韦的耐药形式是在拉米夫定耐药位点基础上加上T184、S202和/或M250变异；二是该区突变有可能引起S蛋白抗原表位改变[29]，两者同时突变有可能影响到病毒的复制能力，使得病毒复制动力学变化，加重内质网压力，增加肝癌发生风险[30，31]。

4 X基因区突变

X基因区（nt1374-1838）是HBV最小的开放读码框架（open reading frame，ORF），可分为 A-F 6 个功能区，序列相对保守。可能在病毒复制中发挥重要作用。HBx可反式激活 BCP，启动 pg-RNA和m-RNA的转录，使HBV复制和表达增强；可与多种细胞因子相互作用而增强原癌基因的表达，促进细胞恶变。HBx加强肝细胞表面 MHC I类和II类抗原的表达，促进 CTL介导的肝细胞坏死。另外，HBx基因在HCC癌变过程中起着重要作用。

5 多基因联合突变

除了上述以研究HBV不同ORF基因突变对疾病转归的影响外，目前多区基因联合突变逐渐得到重视。如前所述，HBV基因组非常紧凑，复制高效。不同基因区相互重叠，比如S基因完全包含在P基因区内，因此某的区基因突变通常会导致其它基因功能的异常。因此，在对不同区基因突变对HBV生物学、机体免疫学等影响进行初步了解后，研究HBV基因突变对疾病的影响应该在将HBV视为一个整体的基础上进行，即不同基因区联合突变的进一步研究。

Preikschat等[32]纵向观察38名肾移植术后感染HBV的患者3年半，其中14名患者随访期间患肝硬化，或死于终末期肝病，24名患者随访期间无肝硬化。发生肝硬化的患者有CP基因的插入缺失伴随C基因的缺失及（或）前S基因的缺失突变。未发生肝硬化的患者没有突变或仅有CP突变。发生肝硬化的患者有如下基因突变特点：1、CP基因的插入缺失伴随C基因的缺失及（或）前S缺失；2、C基因的缺失伴随CP基因的插入缺失及（和）前S缺失。2006年Chen[8]等分析了46名乙型肝炎携带者和106名年龄匹配的不同疾病进程的患者（包括38名慢性乙型肝炎、18名肝硬化、50名肝癌患者）结论：前S缺失和BCP及PC突变患者随着疾病进展发生率增高，Logistic回归分析显示前S缺失联合BCP突变在疾病进展中更有意义，联合突变比单突变更有意义，尤其是联合前S突变患者。2007年Chen[15]纵向研究了141例HBeAg阴性的病例，包括45例无症状携带者、96例慢性乙肝患者。同未发生肝硬化患者相比，发生肝硬化的患者基因C型、前S 区 缺 失 、C/G1753、T1762/A1764、T1766 和/或 A1768、和G1799突变株发生几率更高，Cox回归分析显示，年龄大、高总胆红素，HBV DNA水平、前S缺失、T1766和/或 A1768突变与肝硬化发生有关。患者HBV有复杂变异模式（前S缺失、T1762/A1764、和T1766和/或A1768突变株）的较单位点突变者更易进展至肝硬化阶段。且病毒基因型不同，模式也不一样。更进一步说前S基因缺失突变是肝病进展有意义的危险因素。另有研究结果表明，140名乙肝后肝癌和280名乙肝未患肝癌的病人经多因素分析[33]后，基因C型、病毒载量、A2962G、preS2启动子突变、C105T、T1753V 和 A1762T/G1764A与肝癌的发生独立相关；105C和2962G在肝癌患者中检出率更高；2962G联合preS2启动子突变、105C和1762T/1764A突变在肝癌患者检出率高于其它患者。新近的研究表明[34]：135例乙肝肝癌患者和与之在年龄、性别及HBeAg状态匹配的非肝癌的乙肝患者相比，前S缺失在两者检出明显不同，A1762T/G1764A在肝癌组中检出率增高。两者联合在韩国基因亚型C2中与肝癌发生强相关。

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