荷叶不同饮片黄酮和生物碱类成分对兔体外凝血功能影响的比较

刘 洋， 张学兰， 李慧芬， 隋晓辉， 占方玲

(山东中医药大学， 山东 济南 250355)

荷叶为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶，具有清暑化湿、升发清阳、凉血止血的功效，荷叶炭收涩化瘀止血[1]。现代研究表明，荷叶生物碱和黄酮类成分为其主要活性成分。荷叶总生物碱具有降血脂、减肥、抑菌等作用[2-4]。荷叶总黄酮具有降血脂和保护心肌缺血作用[2,5]。荷叶黄酮类化合物主要为金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、槲皮素等[6]，荷叶生物碱类成分主要有荷叶碱、原荷叶碱、莲碱等[7]。前期研究表明，荷叶炭可明显缩短正常大鼠血浆活化部分凝血活酶时间和凝血酶原时间，增加大鼠血浆纤维蛋白原水平，其止血作用明显强于生荷叶[8]；荷叶制炭后，荷叶碱、总生物碱损失殆尽，金丝桃苷、异槲皮苷量显著降低，而槲皮素量升高6倍多[9-10]。但荷叶饮片止血的物质基础及荷叶制炭止血的机理目前尚不清楚。本实验研究荷叶生、炭饮片总黄酮、总生物碱及金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、荷叶碱对兔体外凝血功能的影响，旨在发现荷叶饮片止血的活性物质，探讨荷叶制炭止血的炮制机理，并为制定荷叶饮片的炮制工艺与质量标准提供科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 健康新西兰大耳白兔，体质量2.2～2.5 kg，购自山东鲁抗医药股份有限公司(许可证号：scxk鲁20080002)。

1.2 仪器 FA1604N型电子天平(精密度为十万分之一，上海精密科学仪器有限公司)；PM PLUS型红外测温仪(美国Raytek公司)；多星电炒锅(淄博多星电器集团有限责任公司)；AYW8000型半自动凝血分析仪(南京瑞麦科技开发有限公司)；LDZ4-0.8型离心机(北京医用离心机厂)。

1.3 药物 荷叶购自山东百味堂中药饮片有限公司，经山东中医药大学中药鉴定教研室周凤琴教授鉴定为睡莲科植物莲NelumbonuciferaGaertn.的干燥叶经加工而成的丝状片。荷叶炭：取净荷叶丝30 g，置电炒锅内，270 ℃(锅底温度)炒制10 min，取出，放凉。成品形如荷叶，表面棕褐色或黑褐色，得率为73.8%。

荷叶碱对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号为111566-200402，纯度大于98%)；槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷(本课题组自制，纯度均大于98%)；枸橼酸钠(天津金汇太亚化学试剂有限公司，批号20110407)；凝血酶原时间测定试剂盒(PT，批号20110915)、活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(APTT，批号20110915)、血浆纤维蛋白原测定试剂盒(FIB，批号20110915)，均购自南京建成生物工程研究所。

2 实验方法与结果

2.1 荷叶生、炭饮片总黄酮的制备 称取荷叶炭粗粉135 g、生荷叶粗粉183 g(按得率计算，相当于炒荷叶炭135 g)，分别用10、8倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏。取浸膏加水超声使其充分混悬，离心，取上清液通过D-101型大孔吸附树脂，先用水洗至无色，再用50%乙醇洗至流出液无盐酸镁粉反应，收集50%乙醇液，于水浴浓缩至干，取残渣，减压干燥，制备成荷叶生品、炭饮片总黄酮。

2.2 荷叶生、炭饮片总生物碱部位的制备 称取荷叶炭粗粉135 g、荷叶片粗粉183 g(按得率计算，相当于炒荷叶炭135 g)，分别用15倍量含0.1%HCl的70%醇浸泡提取3次，每次36 h。合并3次酸醇冷浸提取液，以40%NaOH溶液调pH 9～10。提取液50 ℃减压回收乙醇，得浸膏；干浸膏加少量水溶解，用硅藻土拌样，研细，室温晾干。以10倍量乙酸乙酯索氏提取3 h，减压回收乙酸乙酯；浓缩液用2倍体积的pH1的HCl溶液萃取2次；合并HCl溶液萃取液，以40%NaOH溶液调pH11；再以相同体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，减压浓缩，加入40%NaOH溶液碱析，出现白色絮状沉淀，过滤，真空干燥，所得白色粉末即荷叶生、炭饮片总生物碱。

2.3 供试品溶液的制备 称取荷叶生、炭饮片总黄酮、总生物碱适量，分别加适量80%乙醇超声溶解，得相当于生药浓度0.2 g/mL的溶液，再分别配制成每1 mL相当于0.2、0.02、0.002 g生药的供试液。称取金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、荷叶碱适量，分别加适量80%乙醇超声溶解，分别配成浓度为3、30、300 μmoL/L的供试液。

2.5 结果

2.5.1 荷叶不同饮片总黄酮和总生物碱对兔体外凝血功能的影响 结果表明，生荷叶总黄酮组高、中剂量可明显缩短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01)，低剂量对PT没影响，可明显缩短APTT(P<0.05)；荷叶炭总黄酮组各剂量均可缩短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且荷叶炭总黄酮高剂量组与高剂量生荷叶总黄酮组比较，PT、APTT也显著缩短(P<0.05)，中剂量组对PT的影响也要高于同质量浓度生荷叶总黄酮组(P<0.05)；生荷叶总生物碱组高、中剂量可明显增长PT(P<0.01或P<0.05)，低剂量对PT没影响，高剂量可明显增长APTT(P<0.01)，中、低剂量对APTT无影响；荷叶炭总生物碱各剂量组对PT、APTT均无明显作用；荷叶生、炭饮片总黄酮和总生物碱各剂量组对FIB含量均无明显影响。结果见表1。

表1 荷叶不同炮制品提取物及主要部位对PT、APTT、FIB的影响

2.5.2 荷叶4种化合物对兔体外凝血功能的影响 研究显示，金丝桃苷组高、中剂量可明显缩短PT(P<0.01或P<0.05)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低剂量对PT、APTT无明显影响；异槲皮苷组同上；荷叶碱组高、中剂量可明显增长PT(P<0.01)、APTT(P<0.01或P<0.05)，低剂量对PT、APTT无明显影响；槲皮素组各剂量均可明显缩短PT、APTT(P<0.01或P<0.05)，且与同质量浓度的金丝桃苷组与异槲皮苷组比较，PT、APTT也显著缩短(P<0.01或P<0.05)；但各组对FIB水平均无明显影响。结果见表2。

表2 荷叶4种化合物各单体对PT、APTT、FIB的影响

3 小结与讨论

3.1 体外凝血实验表明，荷叶生、炭饮片总黄酮及金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素均可显著缩短兔血浆PT和APTT，具有较好的凝血活性；荷叶炭总黄酮的凝血作用强于生荷叶总黄酮，槲皮素的凝血作用强于金丝桃苷和异槲皮苷；荷叶碱、生荷叶总生物碱均可明显延长兔血浆APTT和PT，具有抗凝血作用。上述研究说明，黄酮类成分为荷叶生、炭饮片止血活性物质，荷叶碱、生荷叶总生物碱为荷叶抗凝血成分。

3.2 金丝桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)和异槲皮苷(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)的苷元均为槲皮素。为了探讨荷叶金丝桃苷和异槲皮苷在炒炭过程中的转化机制，取金丝桃苷、异槲皮苷对照品，分别置坩埚中，于烘箱中 270 ℃烘制3 min，制备各单体成分模拟炮制品。以槲皮素对照品为对照，采用HPLC对各单体成分模拟炮制品进行分析，结果在金丝桃苷、异槲皮苷的模拟炮制品中均检出槲皮素。说明在荷叶制炭过程中，金丝桃苷、异槲皮苷受热分解生成其苷元槲皮素。

3.3 甲基莲心碱可阻滞钙离子通道、抗血小板聚集和抗血栓形成[11]，莲心碱具有抗血小板聚集和抗凝血作用[12]。荷叶生、炭饮片总生物碱的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱分析表明， 荷叶炭品中莲心碱、N-甲基异衡州乌药碱、杏黄罂粟碱、 衡州乌药碱及2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的含量显著低于生荷叶, 而荷叶中荷叶碱、N-降荷叶碱、番荔枝碱、甲基莲心碱制炭后消失[13]。综合本实验结果，结合文献分析认为，荷叶制炭后止血作用增强的主要原因是：(1)抗凝血成分荷叶碱、甲基莲心碱、莲心碱等生物碱量显著降低；(2)具有止血作用的金丝桃苷、异槲皮苷转化为止血作用更强的槲皮素。本研究为制定荷叶饮片的炮制工艺与质量标准，亦提供了专属性科学依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社， 2010：259.

[2] 黄阿根,施洪飞,韦 红,等.荷叶黄酮和生物碱的提纯及调节血脂作用比较[J].扬州大学烹饪学报,2006,2(3):23-25.

[3] 朱晓青,吕敬慈,霍世欣,等.荷叶生物碱对胰脂肪酶的抑制作用[J].上海大学学报：自然科学版,2007,1(1):85-87.

[4] 唐裕芳,张妙玲,刘忠义,等.荷叶生物碱的提取及其抑菌活性研究[J].广州食品工业科技,2004,20(2):51-52.

[5] 纪 冰,宋 涛,徐晟伟,等.荷叶黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].齐鲁医学杂志，2009，24(6)：515-518.

[6] 王玲玲,刘 斌,石任兵,等．荷叶黄酮类化学成分研究[J].北京中医药大学学报，2008，31(2):116-118.

[7] 王玲玲，刘 斌，石任兵,等.荷叶的化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2009, 21(3):416-420.

[8] 彭 凯，张学兰，王 莉，等.荷叶不同炮制品提取物对正常大鼠凝血功能影响的比较研究[J].中成药， 2013,35(1)：146-149.

[9] 董春永,张学兰,李慧芬.炮制对荷叶中荷叶碱和槲皮素含量的影响[J].中成药,2010,32(6):973-976.

[10] 唐 超,张学兰,徐 鑫.荷叶炮制金丝桃苷含量变化研究[J].山东中医药大学学报,2011,35(1):78-79.

[11] 王 辉, 刘 刚, 罗顺德.莲心碱对血小板聚集、凝血功能和血栓形成的影响[J].中国药理学通报,2010,26(6):768-772.

[12] 俞 晶,胡文淑.甲基莲心碱对大鼠血压、血小板聚集和血栓形成的影响[J].中国药理学通报,1996,12(6)：533-535.

[13] 王 莉，张学兰，孙玉丽，等.高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法分析荷叶炮制前后生物碱成分的变化[J].中成药， 2013,35(4)：146-150.