滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠血糖及血液流变学的影响

俞 浩， 张孝林， 熊友谊， 马世堂

(安徽科技学院食品药品学院，安徽 蚌埠 233100)

中药配伍应用是中医临床用药的基本特点，将中药的有效部位进行合理配伍、组方，即中药的“有效部位配伍”，对于探究中药复方配伍的新模式，丰富中医药理论内涵具有重要意义[1-2]。滁菊ChrysanthemummorifoliumRamat.含有黄酮、多糖、挥发油等多种成分，其中滁菊总黄酮(Chrysanthemummorifoliumflavonoids,CMF)是其主要活性成分之一，具有抗大鼠心肌缺血和心肌缺血再灌注损伤作用，并能改善血液流变学异常[3-6]。白背三七Gynuradiuaricata(L.) DC.含有黄酮、多糖等成分，研究表明，白背三七总黄酮(Gynuradiuaricataflavonoids,GDF)具有改善糖尿病大鼠高血糖症状和脂质代谢异常，抗氧化等作用[7-9]。本实验将滁菊总黄酮和白背三七总黄酮进行配伍，观察该配伍对糖尿病血瘀证大鼠血糖和血液流变学相关指标的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 滁菊总黄酮(总黄酮含有量为76.38%)，白背三七总黄酮(总黄酮含有量为57.3%)，均为安徽科技学院中药及药物制剂实验室制备；糖脉康，中国中医研究院(成都中汇制药有限公司，批号110107)；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ，用时以0.1 mol/L pH 4.2无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制成1%STZ溶液，Sigma公司)；血糖试纸(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)；盐酸肾上腺素注射液(北京永康药业有限公司，批号11103029)；强的松龙注射液(浙江仙琚制药股份有限公司，批号111225)；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP二钠盐，Alexis公司产品)，用时以0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成1 mmol/L的溶液；花生四烯酸(arachidonic acid，AA，Cayman公司产品)，用时以1%的Na2CO3溶液稀释；凝血酶原时间(prothrombin time，PT)测定试剂盒、凝血酶时间(thrombin time，TT)测定试剂盒、活化部分凝血活酶时间(activeated partial thromboplastin time，APTT)测定试剂盒、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器 DL-5低速离心机(郑州长城科工贸易有限公司)；FA21048电子天平(上海市精密科学仪器有限公司)；血糖试纸(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)；安稳血糖测试仪(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)；LBY-NJ2血小板凝聚仪(北京普利生公司)；LBY-N6全自动血流变仪(北京普利生公司)；ACL Futura Plus全自动血凝仪(美国IL公司)。

1.3 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠，体质量220～260 g，购于安徽长临河医药科技有限公司，合格证号为：SCXK(皖)2011-002。

1.4 模型制备 参照文献方法并适当加以改良复制糖尿病血瘀证大鼠模型[10-11]。取大鼠100只，10只留作正常对照，饲喂普通饲料。另90只大鼠饲喂高脂饲料(胆固醇1.0%，猪油10.0%，胆酸0.3%，基础饲料88.7% )，连续28 d。将大鼠禁食不禁水12 h，尾静脉注射STZ(剂量为35 mg/kg)。注射STZ后72 h，尾静脉采血测定FBG，选择FBG在16.8～25.0 mmol/L之间的大鼠作为糖尿病大鼠。然后给糖尿病大鼠肌内注射0.1%强的松龙，0.3 mL/只，每日1次,共13 d。第14天皮下注射0.1%肾上腺素，0.1 mL/只，即得2型糖尿病血瘀证模型大鼠。

1.5 动物分组及给药 取糖尿病血瘀证模型大鼠50只，结合FBG和体质量，采用随机分组法将模型大鼠分为5组，即滁菊总黄酮组(剂量为40 mg/kg)，白背三七总黄酮组(剂量为120 mg/kg)，滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组(剂量为滁菊总黄酮40 mg/kg+白背三七总黄酮120 mg/kg)，糖脉康组(剂量为1.8 g/kg)和模型对照组，并设正常对照组，每组10只。灌胃给药，容量均为0.5 mL/100 g体质量，每日1次，连续给药4周，正常对照组和模型对照组灌胃等容量的生理盐水。

1.6 检测指标

1.6.1 体质量测定 分别于给药第2周、第4周末测定大鼠体质量。

1.6.2 FBG水平测定 给药第4周末，各组大鼠禁食不禁水12 h，尾静脉取血测定大鼠FBG。

1.6.3 全血黏度、血浆黏度测定 给药第4周末，戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主动脉采血，将3 mL血分别置2支抗凝管中，制备全血和血浆。分别取全血和血浆各0.8 mL测定全血和血浆黏度。

1.6.4 血沉和红细胞压积测定 大鼠腹主动脉采血，20 kU/L肝素钠抗凝制备全血，取抗凝血置于长200 mm，内径为2.5 mm清洁、干燥的标准魏氏血沉管中，调至“0”刻度，将血沉管置管架上，室温放置1 h，记录红细胞的沉降距离(mm)。将1 mL抗凝血缓慢加入比积管内，3 500 r/min离心30 min，再离心10 min，至红细胞不再沉降，记录红细胞层的高度，计算红细胞压积。

1.6.5 凝血参数测定 大鼠腹主动脉采血，3.8%枸橼酸钠抗凝(枸橼酸钠∶全血为1∶9，V/V)，取抗凝血，按照试剂盒说明书操作方法，采用全自动血凝仪测定凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间、凝血酶时间和纤维蛋白原水平。

1.6.6 血小板聚集率测定 取3.8%枸橼酸钠抗凝血2 mL，120×g离心10 min，取上清部分即富血小板血浆(PRP)，余血1 200×g离心10 min，取上清部分即贫血小板血浆(PPP)。调PRP中血小板密度为600×109个/L。按照Born氏比浊法，将加有300 μL PRP和小磁棒的比浊管置于血小板聚集仪恒温孔中，37 ℃预热5 min，用PPP调零后，在搅拌情况下分别加入ADP(终浓度为10.0 μmol/L)和AA(终浓度为330.0 μmol/L)诱导聚集，测定血小板聚集率。

2 结果

2.1 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠体质量的影响 由表1可知，给药第2周末，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体质量显著减轻(P<0.05)，各给药组大鼠体质量与模型对照组比较无显著性差异(P>0.05)。给药第4周末，滁菊总黄酮组、白背三七总黄酮组大鼠体质量与模型对照组比较无显著性差异(P>0.05)，滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组大鼠体质量有增加趋势，与模型对照组比较具有显著性差异(P<0.01)。说明滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍能抑制糖尿病血瘀证大鼠体质量减轻。

2.2 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠FBG的影响 由表2可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血糖显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，白背三七总黄酮组、滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组大鼠FBG均显著下降(P<0.01)，其中滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍降血糖作用显著强于白背三七总黄酮(P<0.01)，说明滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍能够起到协同作用。滁菊总黄酮无降血糖作用。

2.3 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠全血黏度及血浆黏度的影响 由表3可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠全血、血浆黏度均显著增加(P<0.01)。滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组、滁菊总黄酮组、白背三七总黄酮组大鼠全血和血浆黏度均显著降低，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。但滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组、滁菊总黄酮组、白背三七总黄酮组3组间大鼠全血黏度和血浆黏度比较无显著性差异(P>0.05)。

表1 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠体质量的影响

表2 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠FBG的影响

表3 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠全血及血浆黏度的影响

2.4 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠血沉及红细胞压积的影响 由表4可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血沉和红细胞压积增加(P<0.01)。与模型对照组比较，滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组、滁菊总黄酮组、白背三七总黄酮组大鼠血沉和红细胞压积显著降低(P<0.01或P<0.05)。其中，滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍降低血沉和红细胞压积作用明显强于滁菊总黄酮和白背三七总黄酮(P<0.01或P<0.05)。

表4 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠血沉及红细胞压积的影响

2.5 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠凝血参数的影响 由表5可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠凝血酶原时间明显缩短(P<0.01)，纤维蛋白原水平显著升高(P<0.01)，活化部分凝血酶时间、凝血酶时间显著缩短(P<0.01)。与模型对照组比较，滁菊总黄酮+白背三七总黄酮、滁菊总黄酮、白背三七总黄酮均能显著延长凝血酶原时间(P<0.01或P<0.05)，但3组间作用比较无显著性差异(P>0.05)。滁菊总黄酮、白背三七总黄酮均能显著降低纤维蛋白原，与模型对照组比较具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)，且滁菊总黄酮+白背三七总黄酮降低纤维蛋白原作用显著强于滁菊总黄酮(P<0.05)。滁菊总黄酮、白背三七总黄酮对活化部分凝血酶时间和凝血酶时间无显著影响，但滁菊总黄酮+白背三七总黄酮能显著延长活化部分凝血酶时间和凝血酶时间(P<0.05)。说明滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍抗凝血作用显著强于单独应用滁菊总黄酮、白背三七总黄酮。

表5 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠凝血参数的影响

2.6 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对ADP和AA诱导血小板聚集的影响 由表6可知，与正常对照组比较，模型对照组ADP和AA诱导的血小板聚集率显著增加(P<0.01)。滁菊总黄酮+白背三七总黄酮组、滁菊总黄酮组和白背三七总黄酮组由ADP和AA诱导的血小板聚集率显著低于模型对照组(P<0.01或P<0.05)，且滁菊总黄酮+白背三七总黄酮对ADP和AA诱导的血小板聚集的抑制作用显著强于单独应用滁菊总黄酮或白背三七总黄酮(P<0.01或P<0.05)。说明滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍在抑制ADP、AA诱导的血小板聚集方面具有协同作用。

表6 滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对ADP和AA诱导血小板聚集率的影响

3 讨论

研究表明，糖尿病患者存在明显的血液流变学异常，血液具有浓、黏、凝、聚等倾向，主要表现为全血黏度、血浆黏度、红细胞压积及血小板聚集性增高，红细胞沉降速率加快等，血液流变学异常是导致糖尿病微血管并发症的重要因素[12]。本实验采用饲喂高脂饲料复合尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)的方法复制2型糖尿病大鼠模型，再注射强的松龙和肾上腺素制备糖尿病血瘀证大鼠模型，结果表明，模型大鼠出现FBG显著升高，全血黏度、血浆黏度及血沉、红细胞压积明显增高，凝血时间明显延长，纤维蛋白原水平显著下降，血小板聚集性增强等变化，说明大鼠糖尿病血瘀证模型复制成功。

本实验前期研究结果显示，滁菊总黄酮40、20 mg/kg均能显著改善糖尿病大鼠血液流变学异常，但40 mg/kg作用要强于20 mg/kg。白背三七总黄酮120 mg/kg、60 mg/kg均能显著降低糖尿病大鼠血糖，但120 mg/kg的作用强于60 mg/kg。因此，本实验确定采用滁菊总黄酮40 mg/kg和白背三七总黄酮120mg/kg配伍，观察该配伍对糖尿病血瘀证大鼠血糖和血液流变学相关指标的影响。

全血黏度是反映血液流变学特性的宏观指标，血浆黏度、红细胞压积及血沉等与全血黏度密切相关[13-14]。单独应用滁菊总黄酮或白背三七总黄酮均能显著降低模型大鼠全血和血浆黏度，降低血沉和红细胞压积。滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍降低血沉和红细胞压积作用显著强于单独应用滁菊总黄酮或白背三七总黄酮。

凝血参数是出血和血栓性疾病的常规检验项目，也是判断药物对内源性、外源性凝血因子和凝血共同通路影响的重要指标[15]。活化部分凝血酶时间主要反映内源性凝血系统状况，其降低说明促凝物质进入血液及凝血因子的活性增高，血液处于高凝状态；凝血酶原时间主要反映外源性凝血系统状况，其缩短见于血液出现高凝状态和血栓性疾病等；纤维蛋白原主要反映血液中纤维蛋白原的量，血栓栓塞性疾病会出现血液中纤维蛋白原量的增加；凝血酶时间主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的时间。本实验研究结果表明，单独应用滁菊总黄酮或白背三七总黄酮能延长凝血酶原时间，抑制ADP、AA诱导的血小板聚集，降低纤维蛋白原水平，但对活化部分凝血酶时间、凝血酶时间无显著影响。滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍能显著延长活化部分凝血酶时间、凝血酶时间，且降低纤维蛋白原作用显著强于滁菊总黄酮；抑制ADP、AA诱导的血小板聚集作用显著强于单独应用滁菊总黄酮或白背三七总黄酮。说明滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍抗凝血、抑制血小板聚集作用显著增强，其作用与影响内源性、外源性凝血因子有关。

本实验从多个指标研究了滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍对糖尿病血瘀证大鼠血糖和血液流变学的影响，结果显示滁菊总黄酮和白背三七总黄酮配伍在降血糖和改善血液流变学异常方面具有协同作用，但该配伍的作用机制有待进一步研究。

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