柴胡与醋柴胡抗大鼠免疫损伤性肝纤维化作用比较研究

汪 巍， 王丽娜， 许 枬， 贾天柱

(辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600)

柴胡为我国传统中药，始载于《神农本草经》，列为上品，称之为地熏、茈胡。《本草纲目》称柴胡是“引清气退热必用之药”。 现代对柴胡的化学成分及药理作用做了大量深入的研究，表明柴胡的化学成分主要有皂苷、黄酮、挥发油、多糖、脂肪酸、甾醇、氨基酸及微量元素等成分，具有解热、镇静、抗炎、抗病毒、抗细菌内毒素、降血脂、保肝利胆、促进酶分泌、抗肿瘤、调节免疫、抗惊厥等药理作用。

柴胡传统炮制方法有多种，主要的有清炒、醋制、鳖血制、酒制和蜜制五种。现行《中国药典》中仅收载南、北柴胡及其醋炙品。清代《本经逢原》柴胡项下提出“入解表药生用，清肝炒熟用”。现在临床应用也认为生柴胡的升散作用较强，多用于解表退热；醋柴胡可以缓和升散及解表退热作用，并可增强疏肝止痛作用，多用于肝郁气滞的胁痛、腹痛及月经不调等症。柴胡醋制前后保肝作用是否存在差异？故课题组针对柴胡醋制前后的保肝作用进行比较研究，本实验针对柴胡醋制前后抗肝纤维化作用进行考察。选用猪血清致大鼠免疫损伤性肝纤维化模型，通过ELISA法测定大鼠血清中PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN的水平，结合肝组织切片及HE化学染色观察，比较柴胡醋制前后抗肝纤维化作用差异。

1 材料和方法

1.1 饮片来源 柴胡饮片购于辽宁正大祥和药业集团有限公司，批号201105245，产地辽宁。

1.2 醋柴胡饮片的制备 生柴胡加入定量米醋(每100 kg用米醋20 kg)拌匀，稍焖润，待醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出晾冷。

1.3 柴胡水煎液的制备 分别将生柴胡和醋柴胡用水煎煮制成1∶2水煎剂(相当于生药)，备用。

1.4 试剂 猪血清(北京雅安达生物技术有限公司，批号120418)；联苯双酯滴丸(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号H33020232)；大鼠Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、大鼠Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)、大鼠黏连蛋白(LN)、大鼠透明质酸(HA)、大鼠纤维连接蛋白(FN)酶联免疫分析试剂盒均购于上海科兴商贸有限公司，批号201211。

1.5 仪器 离心机(上海安亭科学仪器厂，型号,TGL-16C);酶标仪(Thermo上海仪器有限公司，型号，MULTISKAN MK3)；石蜡切片机(德国莱卡公司)；奥林巴斯BX51显微镜。

1.6 动物及分组 雄性SD大鼠，体质量130～150 g，由大连医科大学实验动物中心提供许可证号SCXK(辽)2008-0002，清洁级(CL)。大鼠常规喂养1周后，按体质量随机分为5组，每组10只，分别为生柴胡组、醋柴胡组、空白对照组、模型对照组、联苯双酯阳性对照组。

1.7 实验方法

1.7.1 造模及给药 选用猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化模型，参照文献[1]方法进行造模。大鼠称质量后各组动物以10 mL/kg剂量灌胃给药，空白组和模型组给同体积生理盐水，阳性药组灌胃联苯双酯0.15 g/kg。给药同时每只大鼠腹腔注射血清0.5 mL，每周2次，连续8周。实验结束采集样本前，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第8周末，末次给药后处死大鼠，取血清进行各项指标检测，取肝脏组织做组织切片。

1.7.2 肝纤维化指标检测 大鼠眼内眦取血，3 000 r/min离心5 min,取血清，ELISA法检测PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN、 FN、HA水平。

1.7.3 肝脏病理组织学检查 脱颈椎处死大鼠，取大鼠肝脏组织，切取同一叶同一部位小块肝组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规制片与HE染色，普通光镜下观察病理组织学变化。

2 实验结果

2.1 柴胡及其醋制品对肝纤维化大鼠各项血清指标的影响与正常组大鼠比较，模型组大鼠血清PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN明显升高，与模型组比较，联苯双酯阳性组，生、醋柴胡组大鼠各血清指标均有下降，醋柴胡与阳性药组呈显著下降。结果见表1、表2。

表1 生、醋柴胡对PCⅢ、ColⅣ的影响

表2 生、醋柴胡对HA、LN、FN的影响

2.2 柴胡及醋制品对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响 正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞大小正常，肝细胞索排列有序、肝血窦腔隙规则，无纤维组织增生，肝细胞无变性、坏死及炎性细胞浸润。模型组大鼠显微镜下可见肝小叶间大量纤维组织增生，中央静脉不规则，与汇管区交织成网，形成纤维间隔，肝细胞大面积变性、坏死，肝细胞索排列紊乱，可见大小不等脂肪细胞，细胞间质可见大量的炎性细胞浸润。阳性药组大鼠肝小叶组织形态、结构与模型组比较有明显的好转，小叶间增生的纤维组织明显变薄及消失，脂肪细胞、炎性细胞减少，坏死的肝细胞也有所改善。生柴胡组与模型组比较，肝小叶组织形态、结构有所改善，仍可见肝小叶间粗细不匀、增生的纤维组织形成纤维间隔，少量的炎性细胞浸润及散在的脂肪细胞，肝细胞坏死有所好转。醋柴胡组与模型组比较，肝小叶组织形态、结构恢复较好，肝小叶间纤维组织增生基本消失，肝细胞大小基本正常， 偶尔可见间质有散在的炎性细胞及脂肪细胞， 肝细胞索排列较好。

3 讨论

肝纤维化是由过多的细胞外基质(ECM)在肝内沉积所导致的，伴随着肝纤维化的进程,ECM的量和成分也会发生变化。而ECM的主要成分是胶原，主要是Ⅰ、 Ⅲ和Ⅳ型胶原，尤其是Ⅰ和Ⅲ型是肝纤维间隔的重要来源。ECM的其他成分还包括有粗纤维调节素、纤维连接蛋白(FN)、弹性蛋白、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)和蛋白多糖[2]。本实验结果显示醋柴胡组和阳性药组能够明显降低猪血清所导致的免疫损伤性肝纤维化大鼠Ⅳ型胶原酶、Ⅲ型前胶原酶、层黏连蛋白(LN)酶、透明质酸(HA)酶、纤维连接蛋白(FN)水平，降低肝组织纤维化程度。提示醋柴胡对免疫损伤性肝纤维化大鼠细胞外基质的合成和沉积起到抑制作用，从而起到降低肝纤维化程度，恢复肝脏功能的作用。

柴胡皂苷为柴胡主要有效成分之一，药理活性较强。已经明确，柴胡皂苷具有解热、镇静、明显的中枢抑制、抗炎、特异性阻碍胆碱酯酶、免疫调节、抗病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤、止痛、抗菌、保肝、抗肾炎、利尿等作用[3-5]。猪血清诱导大鼠免疫损伤性肝纤维化的原理主要是猪血清能够刺激大鼠产生抗猪血清的抗体，形成免疫化合物沉积于肝窦和血管壁上，激活补体，引起炎症细胞浸润，释放炎症介质，造成肝细胞损伤、坏死，形成纤维化。而有研究[6]认为柴胡皂苷正是通过其自身抗炎和免疫调节的生物特性，实现其对肝纤维化机制的干预，首先通过抗炎作用减少细胞炎性介质的释放，阻止其启动和加剧肝纤维化过程；其次抑制肝星状细胞激活，调节细胞因子，平衡免疫系统，阻止因细胞因子瀑布效应导致ECM过度沉积，从而起到抗肝纤维化的关键作用。从而证明柴胡皂苷是柴胡抗肝纤维化的物质基础之一。另有实验研究[7]证实:柴胡总皂苷可以改善四氯化碳所致的大鼠肝纤维化，并且具有一定的量效关系。且有研究[8-9]表明生药加工成饮片后，总皂苷量降低，而经醋制后较生品有所升高。表明醋制后柴胡总皂苷的溶出率有所提高。有研究证明柴胡皂苷只有苷元才具有药理作用。而在柴胡中只有部分皂苷以苷元形式存在，在醋制的过程中，米醋提供了酸性的条件，炒制的过程又提供了高温，这有助于柴胡皂苷水解成苷元和糖类，从而增强部分药理作用。这也进一步说明了柴胡醋制后抗肝纤维化的作用优于生柴胡的原因。

参考文献：

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