肾移植与群体反应性抗体

李凯群，周欣莹，黄森林，苗芸（.南方医科大学临床医学八年制，广东 广州5055；.南方医科大学南方医院器官移植科，广东 广州 5055）

群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）是一种由人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）错配产生的免疫球蛋白G（IgG）类型、主要针对HLA的机体内体液免疫抗体。妊娠、反复输血和移植是造成机体内产生PRA的主要原因。大量研究表明：PRA与移植物存活和各种排斥反应（包括超急性排斥反应、加速血管排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应）密切相关。术前筛查PRA可以科学评估肾移植患者的体液致敏状态，为致敏患者选配合适供者；术后监测PRA可及时了解移植肾的免疫状态，有利于防治排斥反应。因此针对PRA的研究在肾移植上具有很重要的临床意义。本文旨在全面详细介绍当前肾移植PRA的研究成果。

1 PRA的研究历史

PRA研究始于1954年，Miescher等［1］首次发现在多次输血的妇女血清中存在白细胞凝集抗体。20世纪60年代起Terasaki等［2］将PRA应用于临床，在肾移植患者的筛选，以及减少移植后超急性排斥反应和加速性排斥反应的发生方面都起到了很好的指导作用。近20年以来，随着体液免疫理论的不断完善及PRA实验技术的发展，PRA在体液免疫的作用越来越受到重视。尤其在2003年Terasaki［3］提出“移植排斥是由体液免疫介导，HLA抗体能迅速或缓慢地杀伤移植物，引起临床上超急性、加速性、急性和慢性排斥反应的发生”后，PRA分析逐渐成为移植排斥反应是否存在免疫因素的重要标准。根据1993年器官共享联合网络（UNOS）的统计，影响移植肾长期存活的因素按程度排序依次为PRA、HLA-B及HLA-DR的错配、移植次数、移植前输血、供者年龄和种族差异。目前PRA被视为移植中最重要的免疫因素。

2 PRA的检测方法

PRA检测是反映移植受者体内HLA抗体水平的试验方法，可识别受者不能接受的HLA抗原。器官移植临床工作的需要推动了PRA检测方法的发展。最初，微量淋巴细胞毒（complement-dependent crossmatch，CDC）试验方法被建立并作为实验室的金标准。随着实验室技术的发展，相继出现了将HLA抗原纯化后吸附于固相载体的酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法及基于流式细胞技术（Flow-PRA）的方法。进入21世纪后，C4d补体依赖流式-PRA（［C4d］Flow-PRA）、液相芯片技术及Luminex技术相继被引入PRA研究领域［1］，使得PRA检测的敏感度得到进一步的提高，保障真正的PRA阴性患者获得更安全的移植及提高PRA阳性的检出率。根据EI-Awar等［4］报道，早期使用细胞毒方法检测，约54%肾移植失败的患者体内有PRA，随着检测方法灵敏度的进一步提高，以往检测无PRA的移植受者体内也发现了抗体，使得PRA检出比率上升到96%，而且其中的50%是术后新检出的抗体［5］。相信随着技术的不断进步，PRA检测的精准程度将越来越高。

3 PRA的产生机制

根据世界卫生组织HLA系统命名委员会的数据，截至2011年10月已发现HLA-Ⅰ类和Ⅱ类等位基因总数达到7059个。HLA-Ⅰ类基因主要包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，所表达出来的抗原存在于几乎所有机体有核细胞表面；HLA-Ⅱ类基因主要为HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，所表达出来的抗原分布于树突状细胞、巨噬细胞、B细胞和其他有抗原提呈功能的细胞表面。在免疫反应中，HLA分子最基本的功能就是结合与呈递抗原多肽。HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类分子都呈递抗原，但它们所呈递的抗原来源不同。内源性抗原（如胞内病毒蛋白），在细胞质中被蛋白酶体消化成短肽，由抗原肽转运蛋白（transporter antigenic peptides，TAP）运输至内质网后，与HLA-Ⅰ类分子结合而呈递到细胞表面，该复合体可被CD8+杀伤性T细胞表面的抗原受体（T cell receptor，TCR）识别并直接杀伤，此即细胞免疫过程；外源性抗原被抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）内吞，摄入胞质的囊泡中，在内吞体或溶酶体中被分解为短肽，进而由HLA-Ⅱ类分子呈递给CD4+辅助性T细胞，后者活化，从而刺激B细胞分泌抗体。此即依赖T细胞抗原引起B细胞介导的体液免疫过程。

在肾脏移植中，受者的免疫系统在接触移植物上的同种异体HLA抗原时，会产生抗供者的免疫应答，Ⅰ类抗原错配是使Ⅰ类抗原成为免疫效应阶段被攻击的靶点，而Ⅱ类抗原错配启动了免疫应答。当供者的HLA抗原肽被递呈给T细胞和B细胞后，同种抗原特异性应答的CD4+和CD8+T淋巴细胞克隆开始增殖，并刺激介导急性、慢性排斥反应的抗-供者HLA抗体产生；若受者移植前已被供者型的HLA抗原致敏，将产生细胞毒性抗体或记忆性T细胞。

在输血、妊娠和器官/组织移植接触同种异体HLA抗原后，都可以使个体被诱导产生抗HLA抗体，即PRA。

HLA抗原水平上的错配会导致PRA的产生。有几个特点值得注意：肾移植早期，HLA-A、HLA-B、HLA-DR的错配对肾移植效果的影响不同，HLA-DR错配的影响最大，HLA-B其次，HLA-A最弱［6］；但在移植后6个月至5年期间，3种HLA抗原有着几乎相同的影响。3种抗原的影响具有累积效应，导致零错配的移植肾在第五年的存活率比完全错配的高17%［7］。有趣的是，当DRB1匹配时，HLA-A和HLA-B也有较好的匹配率，以及移植物存活时间明显延长［8］。

相合程度越高的HLA配对结果能保证越低的排斥反应发生率和更高的移植肾长期存活率。有3、4个错配点的患者与有5、6个错配点的患者相比，有更高的存活率及更低的急性排斥反应发生率［9］。由于HLA系统的高度多态性使临床上难以获得HLA-A、HLA-B、HLA-DR完全相合的供肾，目前绝大部分的移植中心在进行肾移植供受者HLA配型时，采取UNOS提倡交叉反应组（crossreactive groups，CREG）配型或氨基酸残基配型（amino acid residue matching，Res M）策略，在大幅度提高供受者HLA相配概率的同时，显著降低肾移植术后的致敏性和改善移植物的存活率。

HLA等位基因序列对HLA抗原的抗原提呈与相关抗原表位有决定性作用。随着DNA测序技术的不断进步和普遍应用，在骨髓移植上，HLA基因水平上的配对已经日益受到重视，大量研究表明HLA等位基因错配会引起免疫排斥和移植物抗宿主病（GVHD），并明确了15个HLA等位基因错配组合和HLA单倍型错配组合与重症GVHD发生的相关性。这些错配的HLA等位基因组合被定义为高风险错配组合［10-11］。但目前针对HLA等位基因错配对肾移植效果影响的研究依然很少。Heinold等［12］利用来自协作移植研究（the collaborative transplant study，CTS）的血样本和临床数据发现HLA-DRB1等位基因水平上的错配对第一次肾移植没有明显的影响，但对已经致敏的再次肾移植者有非常重要的影响。在美国，非洲裔美国籍肾移植受者的移植肾存活时间比其他美国籍肾移植受者短。Kamoun等［13］发现两者在HLA抗原水平上的错配率没有差别，但前者的HLA等位基因上错配率明显比后者高，这提示我们HLA等位基因水平上的错配会影响肾移植效果。但目前为止，肾移植的受者与供者之间等位基因的错配是否能够引起强烈的免疫反应，从而影响移植肾的存活率依然不是很清楚。

4 PRA与再次移植

初次移植患者PRA阳性率与再次移植患者阳性率比较有显著性差别，再次移植患者移植后发生排异的危险性远远高于首次移植患者。在Sanfilippo等［14］研究中，63%的患者再次移植前PRA水平高于60%，术后容易产生供体特异性抗HLA抗体（donor-specific antibodies，DSA）。如果再次移植遭遇相同抗原时，临床上可表现为超急性排斥反应或者加速性排斥反应。沈清瑞等［15］报道患者体内有些抗体可随时间而消失，一般2个月后降低50%，而有些则较长时间存在，尤其是做过肾移植的患者，PRA消失缓慢，一般7个月后降低50%。对于首次移植失败患者，通过监测PRA，采取综合方法降低PRA水平，可为患者再次移植的时间选择提供依据。

5 PRA与DSA

受者移植前体内PRA峰值特异性包括DSA［16］，即受者接受器官/组织移植后体内产生的针对供者组织抗原的特异性抗体，主要包括HLA抗体和非HLA抗体（如抗内皮细胞抗体、抗波形蛋白抗体、抗MICA抗体和抗MICB抗体等）［17］。若DSA存在，即使有效去除各种HLA抗体使移植前交叉配型阴性、PRA降低甚至转为阴性，急性排斥反应的发生率仍明显增加。Lefaucheur等［18］研究显示，237例肾移植受者中，32例肾移植前存在DSA的患者在术前（n＝18）或术中（n＝14）进行免疫抑制治疗，两组AMR发生率分别为27.8%和57.1%，均显著高于237例中其他肾移植受者的3.9%，提示选择供体应尽可能避开受者PRA峰值时的全部抗体谱。术后产生的DSA直接针对供者组织抗原，在补体的作用下对移植物造成不可逆性损伤，从而降低移植物的长期存活率。所以移植后检测出DSA是预示急性排斥反应（acute rejection，AR）发生和移植物丧失的良好标志。因此术后检测肾移植受者PRA或（和）DSA的变化可作为替代移植肾穿刺活检的无创检查手段，为临床诊疗提供重要的参考依据，是肾移植后调整免疫抑制方案的必要手段。

6 PRA与超急性、急性、慢性排斥反应

移植前PRA水平能反应受者对HLA抗原的致敏状态，对移植前预测排斥反应有重要作用。陈国栋等［19］研究显示，术前PRA水平越高，肾移植接受率越低，术后发生急性排斥和慢性排斥的风险越高，移植肾的长期预后也越差。受者移植前PRA≥30%（高度致敏）更是发生超急性排斥、加速排斥等严重排斥反应的临界值。移植后PRA强度是排斥反应发生的重要指标，与移植物失功呈正相关，在术后能预警移植物的丧失，这能使器官移植后各种排斥反应的发生率显著降低。

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根据宿主抗移植物反应（host versus graft reaction，HVGR）发生的时间、强度、病理学改变特点及其机制，可分为超急性、急性、慢性排斥反应三种类型。目前超急性和加速性排斥少见，急性排斥成为临床检测重点。

目前研究基本明确PRA重度阳性的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类抗体高敏受者，特别是抗供者HLA特异性抗体阳性患者，可导致移植后超急性排斥反应（hyperacute reaction，HAR）发生。HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类抗体高敏状态，是导致肾移植后HAR发生的主要因素，因此强调对高敏人群做PRA配型或随机淋巴细胞毒性试验。移植肾超急性排斥反应是一种反应最急剧、后果最严重的排斥反应，一旦发生只能尽早切除移植肾。因受者多次输血或妊娠而受到同种HLA免疫致敏所产生的PRA，也是造成超急性和加速性排斥反应和移植物丢失的危险因素之一。

PRA对预测移植肾AR具有重要意义。Kerman等［20］报告术前PRA＞10%的肾移植受者术后AR发生率可达70%。Katznelson等［21］证实移植前PRA水平的峰值比在手术时的PRA更能预测移植物的存活结果，高致敏者在住院期间就易出现早期急性排斥。组织相容性抗原/基因，主要以HLA-A、HLA-B、HLA-DR为主的位点，供受者之间相合位点越多、误配率越低，则术后发生早期急性排斥反应的比率越低。Domingues等［22］通过PRA阳性筛选发现在肾移植术后阶段特异性HLA抗体可能与急性排斥发作同时出现。Kaufman［23］在2003年已提出用不同方法检测PRA（如ELISA-PRA、AHGPRA）对急性排斥表征的早期风险估计可能有用。

慢性排斥反应（chronic rejection，CR）属于迟发型变态反应，多发生在肾移植后数月或数年内，移植物功能逐渐减退或丧失，呈隐匿性。在其发生因素中，术前HLA配型不理想、肾移植后早期发生多次急性排斥等主要因素，均与术前、术后PRA密切相关。持续监测PRA（术前、术中、术后），并对大量肾移植病例PRA数据进行统计学分析得出趋势性规律，对CR的发生可能性和发生程度都有预测作用。

7 PRA与慢性移植肾失功

移植后移植肾长期存活患者，由于各种免疫性（CR、HLA配型、移植后抗体等）和非免疫性因素（神经钙调素抑制剂肾毒性、高血压、高血脂、高血糖等）的共同作用，移植肾功能逐渐减退直至丧失。这种慢性移植肾失功患者，目前已占临床移植患者的大多数。将慢性移植肾失功与短期失功比较，发现前者PRA阳性率及中度以上致敏率显著低于后者。慢性移植肾失功患者单纯HLA-Ⅱ类抗体阳性占多数。对再次肾移植慢性肾移植失功患者来说，如PRAⅠ类抗体阳性，可确认其处于免疫高敏状态；如PRA阴性或仅为Ⅱ类阳性，认为其体液免疫状态与初次移植患者相比无明显差异，不能与短期移植肾失功患者等同列入免疫高危人群。

8 PRA与治疗方案

PRA对整个移植治疗方案的制定起到了重要作用。目前强调PRA监测在整个治疗过程中的持续性，包括移植前预治疗、术前、术中、术后以及移植后3个月、6个月、1年、3年、5年等。持续性监测PRA为治疗方案提供依据并判断治疗效果。

等待移植供肾期间，高PRA患者进行肾移植应慎重。一直以来，对高致敏患者移植前的治疗普遍思路为通过血浆置换（plasmapheresis）、免疫吸附（immune adsorption）和使用免疫抑制剂等方法脱敏，降低患者PRA。近期研究发现，低剂量静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）或利妥昔单抗等治疗也可能有助于患者脱敏［24］。PRA作为判断患者致敏的金标准，移植前检测PRA水平是临床上判断高敏患者预治疗效果的重要手段。

不同水平PRA对药物治疗方案选择特别是诱导物选择有重要影响。对高PRA患者，美国率先使用三联疗法（triple therapy），通过药物诱导降低和预防肾移植术后排斥反应特别是AR的发生。1987-1993年，美国率先使用抗淋巴细胞球蛋白（ALG）或抗CD3单克隆抗体（OKT3）等；1994-2002年新增加了兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、巴利昔单抗、赛尼哌（Zenapax）；到了2009年，IVIG（20%）与利妥昔单抗（Rituximab，11%）作为高致敏患者最常用药剂。

在众多诱导药物中，兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白是过去10年间最常用的方案，未致敏患者使用率从10%升至46%，PRA＝1%～49%患者使用率从12%升至57%，PRA＝50%～100%患者使用率从19%升至63%。高致敏患者使用阿仑珠单抗、IVIG、利妥昔单抗的百分比也分别上升至16%、20%、11%。在过去5年中，PRA为0、1%～49%、50%～100%的患者对应的类固醇限制使用比例为33%～36%、30%～37%、10%～25%。麦考酚钠从2005年开始使用率有所增长，并很有可能逐渐代替 MMF［25］。

目前，诱导剂中抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）以及其与其他诱导剂联合使用成为研究的热门，该方向的研究中均强调不同PRA水平下选择不同的诱导方案。对于PRA中度致敏的尸肾供肾移植受者，Brokhof等［27］发现同巴利昔单抗比较，ATG与减少新发DSA（de novo DSA，dnDSA）和抗体介导的排斥反应（antibodymediated rejection，AMR/ABMR）之间更具有相关性。Pilch等［28］发现，若使用兔抗胸腺细胞球蛋白（rabbit ATG，rATG）对致敏患者的排斥反应发生率没有影响，还对低PRA的受者有增加BK病毒感染的风险。Ejaz等［29］发现对高免疫风险的肾移植人群在使用rATG同时联合使用利妥昔单抗可以增加使用的安全性，而添加硼替佐米（bortezomib）可能会增加毒性。

PRA除了在传统治疗手段中作为重要指标外，对完善现有的治疗方案和开展新的治疗方法也有重要意义。如对高PRA患者进行A蛋白免疫吸附（protein A immunoadsorption，IA）补充了诱导疗法，可以预防和减少移植后排斥反应［30］。还有研究指出，通过对供者干细胞灌注进行增加持久嵌合性诱导发现低致敏患者易达到治疗效果而高致敏患者很有可能治疗无效［31］。