染料木黄酮抑制肿瘤血管生成的研究进展

王巧焕 赵素芬

·综述与讲座·

染料木黄酮抑制肿瘤血管生成的研究进展

王巧焕 赵素芬

染料木黄酮；血管生成；抑制

大豆中天然存在的黄酮类化合物主要有3种，即大豆甙类(daidzin)、染料木甙类(genistin)、黄豆甙类(glycitin)，其中又以染料木黄酮(genistein)含量最多，活性最强，其化学名为4,5,7-三羟基异黄酮。研究表明genistein作为天然的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，具有多种生物学活性，如雌激素样作用、抗雌激素样作用、抗氧化和调节细胞周期等，近年来因其显著的防癌抗癌效果而倍受关注[1-3]。国内外的诸多研究已经证实，genistein在抑制肿瘤血管的生成方面具有显著的作用，而肿瘤血管生成几乎存在于肿瘤生长和转移的每一步中，因此genistein抑制血管生成过程从而抑制肿瘤生长和转移的作用机制成为近年来的研究热点[2，3]。其机制和作用途径综述如下。

1 蛋白酪氨酸激酶途径

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。它可分为受体型和非受体型酪氨酸激酶。其中受体型酪氨酸激酶与肿瘤血管生成关系较为密切，genistein抑制受体型酪氨酸激酶主要通过以下几个途径：

1.1 血管内皮生长因子(VEGF)途径 VEGF是促血管生成中最重要的因子，它的表达及受体的功能是肿瘤生长、侵袭、转移必不可少的。Luo等[1]在体外研究genistein抑制卵巢癌细胞生长和VEGF的表达时，分别检测VEGFmRNA、VEGF蛋白的表达，证实了genistein对VEGF具有强大的抑制效应，从而能有效的抑制肿瘤血管的生成。而genistein在体内抑制肿瘤血管生长的功效是通过裸鼠移植瘤模型和鸡胚绒毛尿囊膜测定的，试验中观察到移植瘤模型中微血管密度显著减少，证实了genistein在体内也能有效的抑制肿瘤血管的生成。而对于其机制的研究，韩彬等[2]用脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象，在实验中通过测定caspase-3和PTK的活性，证实HUVECs经VEGF刺激后，PTK活性升高；genistein处理组的ECs凋亡率和caspase-3活力与空白对照组相比分别增加了1.81和1.72倍，与VEGF处理组相比，两者分别增加了2.01和2.02倍，说明genistein可能是通过抑制PTK激酶活性，诱导VEGF处理的内皮细胞凋亡。但Yang等[3]发现在乳腺癌中ER+/rebB-2+细胞中，低浓度的genistein的雌激素活性作用可以抵消它的PTK抑制作用，因此在应用genistein的抗肿瘤作用时一定要注意其浓度。

1.2 成纤维细胞生长因子(FGF)途径 目前诸多研究显示FGF在促进肿瘤血管的生成和生长中具有重要作用。Zhang等[4]在研究aFGF在上皮性卵巢癌中的表达及其信号转导途径时发现，40例上皮性卵巢癌细胞中aFGF和FGFR1表达较对照组升高，加入外源性的PKC 和 ERK可以使aFGF和FGFR1表达增加，并且呈剂量依赖性，genistein处理后可以明显降低外源性的PKC和ERK活性，这说明genistein可能是通过降低PKC和ERK的活性来调节aFGF的表达，从而抑制卵巢癌的血管生成。Rajiv等[5]在研究人类恶性神经母细胞瘤时发现加入genistein后磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达明显增加，而PTEN的增加可以抑制血管生成及生长因子的调节基因N-Myc，N-Myc在肿瘤微环境中可以激活血管生成因子VEGF、FGF及侵袭因子基质金属蛋白酶等，说明genistein可能是通过上调PTEN的表达来中断VEGF、FGF介导的血管生成信号转导通路。综上所述，genistein通过抑制或激活FGF的上游基因，进而抑制FGF的表达，实现对肿瘤血管的抑制。

1.3 转化生长因子(TGF)途径 TGF-β是调节细胞增殖的重要因子，在血管生成过程中，TGF-β信号上调是其重要的特征，国内外诸多研究发现genistein可以显著抑制TGF-β信号传导途径，从而抑制肿瘤血管的生成。至于具体机制，Di等[6]在人尿道平滑肌瘤细胞中发现高浓度的genistein(50 μg/ml)可以有效地抑制TGF-β信号转导途径，Western blot试验进一步发现在genistein治疗组，activin A 和Smad3 的蛋白表达均降低了，而Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，激活素(activin)则是TGF-β超家族球蛋白成员之一。Janet等[7]在综述大量文献的基础上指出genistein可以抑制TGF-β→MEK4→p38MAPK→MAPKAPK2→HSP27→MMP-2信号转导通路，其中已知TGF-β、MAPK 、MMP-2均参与肿瘤血管的生成及肿瘤的侵袭和转移。由此我们可以推出genistein抑制TGF-β信号通路中的关键分子及其家族成员，进而抑制肿瘤血管的生成。

1.4 胰岛素样生长因子(IGF)途径 众所周知，IGF可以促进肿瘤血管的生成。Rabiaz等[8]在研究genistein对前列腺癌组织中细胞周期及血管生成的影响时发现genistein明显降低IGF1mRNA及蛋白的表达。Lee等[9]发现在前列腺癌PC3细胞中genistein治疗组可显著降低IGF-1刺激的G0/G1期细胞生长，genistein还明显抑制IGF-1R及其下游基因(Src，Akt等)的磷酸化，同时还可降低E-钙粘蛋白的水平。体内试验中，genistein对IGF-1同样有明显的抑制作用：Curt等[10]在患有前列腺癌的十二周大小的SV-40 Tag大鼠中，分别喂食genistein，resveratrol(白藜芦醇)，低剂量的genistein+ resveratrol，高剂量的genistein+resveratrol 12周，结果显示以上药物对IGF-1均表现为明显的抑制作用。

2 非酪氨酸激酶途径

2.1 基质金属蛋白酶(MMPs)途径 基质金属蛋白酶是一种水解酶，它通过降解细胞外基质来促进肿瘤的侵袭和转移，genistein可以通过抑制MMPs减少血管的生成和降低肿瘤的转移能力[11]。在genistein作用的前列腺癌细胞PC-3中，genistein在有效降低MMP-9，MMP-2表达的同时，可显著地下调蛋白酶M、uPAR、VEGF、神经生长因子、TSP、BPGF、LPA、TGF-β、TSP-1和PAR-2的水平，同时上调组织连接生长因子和组织连接活性多肽的表达水平，而以上基因均与肿瘤血管生成和肿瘤转移有关。在通过随机抽样方法获取的临床Ⅱ期前列腺癌患者中，genistein治疗组MMP2的表达水平明显低于非治疗组[12]。这些发现进一步支持了在前列腺癌中genistein通过抑制MMP-2的活性而抑制癌细胞侵袭的研究报道[13]。Xu等[14]研究发现在前列腺癌中丝裂酶原蛋白激酶激酶-4(MEK4)可以激活刺激MMP2的表达和癌细胞的侵袭，值得注意的是，genistein在毫微摩尔级浓度时即可抑制MEK4的活性，因此genistein可以通过抑制MEK4的活性抑制MMPs和细胞的侵袭。用c-erbB-2转染的乳腺癌细胞MDA-MB-435中，c-erbB-2、MMP-2、和MMP-9的表达明显增加，但在genistein治疗组中，这些高表达的因子则显著降低，说明在乳腺癌细胞中genistein通过抑制c-erbB-2最终抑制MMPs的表达也是其抑制肿瘤血管生成的一条途径。已知TIMPs是MMPs的一种特殊抑制剂，据报道在乳腺癌细胞中，genistein通过下调MMP-9 并上调TIMP-1来抑制肿瘤细胞的侵袭和血管的生长。综上述，genistein可以通过多条途径抑制MMPs，进而抑制肿瘤血管的生长及肿瘤的侵袭转移。

2.2 缺氧诱导因子-1(HIF-1)途径 HIF-1是一个具有特异性转录活性的异源二聚体转录因子，通过调控转录因子对血管内皮生长因子的表达，抑制肿瘤血管的生成，在肿瘤的形成和浸润转移中具有重要意义。在诸多的体外试验中，Guo等[14]研究发现，genistein可以显著的抑制前列腺癌细胞PC-3中HIF-1α在细胞核内的堆积；在人卵巢细胞中进一步研究发现，HIF-1是通过磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)AKT信号通路调节VEGF的转录活性，最终影响肿瘤血管的生成。而在体内试验中，Rajesh等[15]在研究黄酮类化合物抑制血管生成及抗肿瘤的分子机制实验中，通过鸡胚绒毛尿囊膜试验及血管造影方法显示genistein对血管生成具有强大的抑制作用；他利用分子对接试验进一步证明了genistein可以通过抑制促血管生成因子HIF、VEGF、VEGFR等受体与配体的结合进而有效的抑制血管的生成。然而，Yu等[16]在研究土槿皮乙酸(PAB)对人乳腺癌细胞MCF-7的凋亡和坏死的影响时发现genistein可以逆转PAB对MCF-7的诱导凋亡和坏死作用，这说明genistein在临床应用中应谨慎，尤其和其他药物联合应用时。

2.3 环氧化酶-2(cox-2)途径 cox-2是诱导酶，在各种刺激如生长因子，细胞因子，致癌因子等作用下其表达增加。cox-2高表达的肿瘤组织中微血管的密度明显多于低表达者。肿瘤中微血管的密度是恶性肿瘤侵袭和转移等生物学行为的重要指标，研究表明genistein可有效的抑制诱导型的COX-2的表达。研究发现核转录因子κB(NF-κB)可以促发cox-2和促炎因子IL-6、IL-1和TNF-α的转录，而Ma等[17]在人胃癌细胞系BGC-823中发现genistein治疗组COX-2的蛋白水平及NF-κB活性明显降低，并且呈剂量依赖性，另外，他又进一步证实NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸对COX-2蛋白水平及NF-κB活性的抑制与genistein对二者的抑制作用是一致的。Kham等[18]也发现在小鼠皮肤炎症中genistein可以显著地抑制NF-κB途径，显示出强大的抗炎抗肿瘤活性。对于其进一步机制的探讨，Ma等[17]在研究genistein增强三氧化二砷抗肝细胞性肝癌中Akt与NF-κB转导通路时发现genistein在体内可以下调PI3K-AKT，NF-κB及其基因调控产物COX-2、cyclin D1、Bcl-2、Bcl-xL、VEGF等，最近研究显示PI3K-AKT可以通过增强P65亚单位的转录活性进而激活NF-κB，而在胰腺癌细胞中[18]，也有报道证实genistein通过抑制Notch-1的活性而使NF-κB及细胞生长被抑制[17]。综合以上实验及发现说明genistein可能是通过NF-κB途径抑制COX-2的蛋白表达。

2.4 丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)途径 uPA在许多癌症中表现为过度表达，uPA-uPAR系统通过与细胞表面的分子(整合素、玻璃体结合蛋白等)相互作用以及激活相关的信号转导通路，参与肿瘤的增殖、侵袭、转移及血管的生成等。据报道genistein在前列腺癌细胞和TRAMP小鼠中均可抑制uPA的生成。Han等[19]在胰腺癌细胞系Panc-1 中发现，genisten可以通过下调uPA及MMP-2的mRNA和蛋白水平，进而抑制TGF-β介导的细胞侵袭及转移，其进一步的分子机制genistein可能是通过Smad4依赖性或非依赖性途径(p38 MAPK )调节肿瘤活性。总之，以上体内外研究表明uPA-uPAR信号转导途径可作为genistein抗肿瘤的作用靶点。其抗肿瘤血管生成和转移的机制尚需进一步的探究。

2.5 微小RNA(miRNA)途径 miRNA是近年来研究的热点。目前已在人类基因组中鉴定出700多种，参与调控约30%的基因表达和翻译。最近研究表明miRNA 通过调控细胞增殖、分化、凋亡、应激反应等，不仅在肿瘤的生长、侵袭、转移中发挥重要作用，而且在血管新生过程中也具有不可轻视的地位[20，21]。熊建宁等[20]成功构建了血管内皮生长因子miRNA 表达载体，证实genistein在体外能有效抑制 HepG2 细胞血管内皮生长因子基因表达。Liu等[21]采用鸡胚绒毛尿囊膜试验证实在人前列腺癌细胞DU145中高表达的miRNA-21诱导肿瘤血管的形成。其机制为miRNA-21可以靶向抑制PTEN的表达，并且部分激活PI3K/Akt、ERK1/2信号转导通路，进而促进肿瘤血管生成关键分子HIF-1a、VEGF 的表达。而Zaman等[22]在有关肾癌的体内外试验均证实genistein可以有效的抑制miRNA-21的表达，体内试验组其表达下降了40%。因此，genistein抑制miRNA水平也将是其抑制肿瘤血管生成的一条有效途径。

2.6 其他途径 Genistein抑制肿瘤血管的生成还包括其他方面，如抑制促血管生长因子溶血磷脂酸、蛋白酶M、肿瘤相关的巨噬细胞、血小板反应素、骨来源的生长因子、蛋白酶活化受体-2、肝细胞生长因子、ROS、神经纤毛蛋白等，同时上调结缔组织激活多肽，结缔组织生长因子等。

综上所述，肿瘤血管的形成在实体肿瘤的生长过程中至关重要，而肿瘤血管的生成又是一个复杂的多步骤过程，genistein对肿瘤血管的抑制分为蛋白酪氨酸激酶途径和非蛋白酪氨酸激酶途径，但是途径中具体机制仍不十分清楚，尚需进一步研究。但是我们相信genistein作为一种天然无毒的植物类化学药物，无论是其单独应用还是与其它化疗药物联合应用，都将为临床肿瘤的预防和治疗提供一个良好的前景。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.14.045

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赵素芬，050000 河北医科大学第二医院；

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2014-01-17)