RNAi沉默Skp2抑制胃癌细胞SGC7901侵袭作用的实验研究

张连峰，魏 争，韩利坤，张绪文，乔海泉

(哈尔滨医科大学附属第一医院普通外科,哈尔滨 150001)

胃癌是一种常见的消化道肿瘤，全球发病率居恶性肿瘤的第五位，病死率居恶性肿瘤的第三位[1]。在发展中国家，胃癌的5年生存率<20%，意味着>80%的胃癌患者存在复发或远处转移的可能[1]。近年来，基因靶向治疗已经逐步成为新的肿瘤诊断和治疗手段，并且取得初步成果[2]。S期激酶相关蛋白2(Sphase kinaseassociated protein 2,Skp2)在大量实体肿瘤中呈高表达，现已证实其具有癌基因的潜能并与恶性肿瘤的分化程度及预后密切相关[3]。本研究使用RNAi沉默Skp2，观察其对胃癌细胞株SGC7901侵袭能力的影响，为胃癌的基因靶向治疗提供新的策略和途径。

1 材料与方法

1.1材料 SGC7901胃癌细胞株购自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院实验中心，质粒由日本广岛大学Yasusei Kudo教授惠赠，Skp2羊抗人抗体、p21小鼠抗人抗体、p27小鼠抗人抗体、Kazal基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白(reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motif，RECK)小鼠抗人抗体、Sp1小鼠抗人抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶小鼠抗人抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司，质粒小提试剂盒购自美国Romega公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天科技公司。化学发光显色液购自美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1胃癌细胞培养 将胃癌细胞株SGC7901接种于含10%胎牛血清、链霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、NaHCO31 g和谷胺酰胺0.3 g的RPMI1640培养液，于37 ℃、5% CO2孵箱(日本SANYO公司 型号MCO-15AC)中培养；取对数生长期细胞进行传代和处理。

1.2.2稳定转染细胞株的获取 pSuNeo-Skp2表达质粒由日本广岛大学Yasusei Kudo教授赠予，正义链为：5′-tcgaGGGAGUGACAAAGACUUUGgaguacugCAAAGUC

UUUGUCACUCCCUUUUU-3′；反义链：5′-ctagAAAAAGGGAGUGACAAAGACUUUGcaguacucCAAAGUCUUUGUCACUCCC-3′；设计序列对应114-133位核苷酸(GenBank NM_005983.2)。阴性无功能序列包含与上述阳性质粒相同的核苷酸，但为乱码序列，且与其他种属无同源性。常规方法提取纯化质粒，用紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂，型号：UV-754)测定质粒浓度。细胞培养，取对数生长期的细胞接种于6孔板内，每孔6.0×105个细胞，然后参照LipofectaminTM2000 Regent(Invitrigen)说明书进行操作转染；转染48 h后，用0.25%胰酶消化转染的细胞并用培养液重悬细胞，以2000个/mL密度接种至24孔板内。细胞贴壁后加入G-418，浓度分别为100～1000 μg/mL，设置每100 μg/mL为浓度的梯度；细胞培养2周后确定筛选浓度为300 μg/mL，维持浓度为150 μg/mL培养细胞并获得阳性克隆株。设立阴性质粒为对照组、携带目的基因质粒转染组为实验组。

1.2.3侵袭实验 按试剂说明配制Matrgel胶并加入到Transwell小室内，干燥1 h；取对照组和实验组SGC7901细胞，胰酶消化离心后重悬于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整浓度为5.0×104/mL细胞取200 μL加入至上室，并在下室中加入1500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液；将24 孔板置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内孵育24 h。取出Transwell小室，棉签擦掉上室内Matrgel胶及上室内底部细胞。4%甲醛固定聚碳酸酯膜下层细胞，然后行Giemsa染色，200倍高倍镜(日本 OLYMPUS公司，型号：SZ)下任取5个独立视野观察并计算穿膜细胞数目。

1.2.4明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9活性 每组取相同数目的细胞在无血清培养液中培养24 h；次日收集上清液，将上清液移入离心管中离心10 min(2000 r/min)(德国Heraeus公司高速低温离心机，型号：Biofuge Primo R)；与4×上样缓冲液按照1∶4混合；配制分离胶和浓缩胶,4 ℃进行SDS-PAGE电泳100 V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为90 mA恒流；电泳结束后,将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次,每次30 min,然后用漂洗液漂洗2次,每次20 min，接着将凝胶置于孵育液中37 ℃孵育过夜；孵育结束后经染色液(0.1% Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色1 h,及脱色液(甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%)分别脱色30 min、1 h、2 h后，显示出pro-MMP-2(66×103)和active-MMP-9(92×103)为位于蓝色背景上的透亮带。

1.2.5Western-Blot检测p27、p21、Sp1、RECK蛋白表达 常规培养对照组和实验组SGC7901细胞,取对数生长期细胞,加入裂解液,提取总蛋白，用二喹啉甲酸测定蛋白浓度；同等体积的蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至硝酸纤维膜；5%脱脂牛奶封闭、洗膜后将膜放置于一抗(1∶250)中室温孵育3 h,用缓冲液(1×Tris-buffered saline中加入0.1% 吐温20，pH 7.2～7.4)洗膜3次，每次5 min；然后将膜置于二抗(1∶500)中室温孵育3 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化学发光法显色,用凝胶光密度分析软件分析阳性条带,测其积分光密度值。每组实验重复3次，用内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶标准化后计算相应蛋白变化。

2 结 果

2.1Skp2-shRNA沉默Skp2表达后胃癌细胞SGC7901侵袭能力的变化 侵袭实验显示：实验组肿瘤细胞侵袭能力显著低于对照组[(38.1±4.3)个 vs (67.3±7.4)个](P<0.05)(图1)。

2.2沉默Skp2后胃癌细胞SGC7901 MMP-2和MMP-的活性变化 明胶酶实验显示：与对照组相比，实验组pro-MMP-2、Active-MMP-9活性下降(图2)。

2.3Skp2-shRNA沉默Skp2表达后各个蛋白的表达 Western Blotting结果显示：沉默Skp2后，实验组与对照组相比，Skp2显著减少[(86.4±5.9)% vs (21.7±3.1)%](P<0.001)，p27[(47.2±6.1)% vs (92.5±7.8)%]和RECK[(43.2±5.3)% vs (78.8±7.9)%]表达显著增加(P<0.01)，p21增加[(53.3±3.6)% vs (81.4±8.2)%](P<0.05)，Sp1减少[(77.2±9.7)% vs (41.5±8.6)%](P<0.01)(图3)。

*与对照组相比，P<0.05

图3 Skp2-shRNA沉默Skp2表达后胃癌细胞SGC7901各个蛋白表达变化 3A：两组胃癌细胞SGC7901各个蛋白表达变化； 3B：两组胃癌细胞SGC7901各个蛋白表达的比较；与对照组相比，#P<0.001，++ P<0.01，+P<0.05，** P<0.01

3 讨 论

细胞周期中的正性和负性调控因子共同维系、严密调控细胞周期，Skp2的本质是泛素蛋白酶体途径中E3酶F-box蛋白，通过特异性识别p27、p21并介导其泛素化降解。在对多种恶性肿瘤的研究中发现Skp2均呈过表达，相应地p27、p21则是低表达，且两者呈负相关，p27、p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的一员，在人体多种恶性肿瘤细胞增殖和分化的调控中起着非常重要的作用[4]，上调p27、p21蛋白可以抑制肿瘤细胞的增殖和诱导细胞周期G1/S期阻滞[5]。MMP-2、MMP-9能够降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原,为肿瘤细胞的侵袭提供条件[6]，RECK是MMPs的抑制剂,通过封闭MMPs活性抑制恶性肿瘤侵袭，增强RECK表达使MMPs表达下调并抑制肿瘤细胞转移[7]。Sp1被认为是一种转录水平的活化基因[8],且Sp1为RECK上游调节因子，能够在基因水平对RECK进行负向调控[9]。另有实验证明，Skp2过度表达可促进MMPs表达上调，增强其活性，进而促进肿瘤细胞转移[10]。因此，本研究在SGC7901细胞中采用RNAi技术沉默Skp2表达后，观察能否下调Sp1，增强RECK蛋白表达，降低胃癌细胞在体外的侵袭能力，并揭示其相关机制。

侵袭实验显示：沉默Skp2表达后，实验组侵袭细胞数减少。为进一步揭示其机制，分别通过明胶酶谱法和蛋白印迹实验检测MMPs的活性及p27、p21、Sp1、RECK蛋白的表达。明胶酶实验显示：金属蛋白酶MMP-2、MMP-9活性较对照组显著下降；蛋白印迹实验显示：实验组较对照组p27、p21和RECK表达上调，Sp1表达下调，说明在胃癌细胞SGC7901中，过表达的Skp2可能是通过增强Sp1蛋白表达进而增强肿瘤细胞的侵袭能力，沉默Skp2蛋白表达后，Sp1蛋白表达下调，抑制胃癌细胞侵袭能力。而Sp1蛋白的表达下调是由沉默Skp2直接导致，还是沉默Skp2后p27、p21蛋白的表达上调所致还需进一步研究。

综上所述，在胃癌细胞株SGC7901的实验研究中Skp2-shRNA可作为一种抑制Skp2表达的有效工具，通过下调Sp1蛋白表达，增强RECK蛋白表达，进而产生抗侵袭效应，这为胃癌转移的基因靶向治疗提供了新的策略和途径。

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