日本蟳高血糖激素基因的克隆与表达分析

汤 洁， 朱冬发， 崔晓雨， 谢 熙， 邱锡尔

(宁波大学 海洋学院， 浙江 宁波 315211)

高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)是由X器官-窦腺复合体(X-organ-sinus gland complex, XO-SG)合成分泌的一种肽类激素[1-3]。在甲壳动物中，CHH调节血糖水平，参与蜕皮、繁殖等生理过程[2, 4, 5]。XO-SG是甲壳动物内分泌的调控中心，其合成分泌的肽类激素统称为CHH家族神经肽，根据基因结构不同，可分为I型神经肽和II型神经肽[6]。I型神经肽仅有CHH，II型神经肽有蜕皮抑制激素(MIH)、大颚器官抑制激素(MOIH)和性腺抑制激素(GIH)[1-3]。区别在于：CHH的信号肽与成熟肽之间存在着一段特有的CHH前体相关肽(CHH precursor-related peptid, CPRP)，而MIH、MOIH和GIH的信号肽直接与成熟肽相连[7]。近来，CHH在甲壳动物生长、发育、繁殖中的调控作用越来越受到重视[7-9]。

目前，已从多种甲壳动物中克隆获得了CHH全长cDNA序列[10,11]。对CHH的组织差异性表达研究发现，除了眼柄，CHH还在甲壳动物的其它组织中广泛表达[10]。但是，不同物种间的CHH组织表达情况存在差异。例如：榄绿青蟹(Scyllaolivacea)的CHH在脑中有表达，在肝胰腺、心脏、肌肉和鳃中不表达[12]；拟穴青蟹(S.paramamosain)的CHH在肝胰腺、心脏和肠中表达量较高，在鳃和胃中的表达量较低[13]；日本沼虾(Macrobrachiumnipponens)的CHH在精巢中表达量较高，在肝胰腺和心脏中的表达量较低[14]。

随着海洋经济的快速发展，日本蟳(Charybdisjaponica)已成为中国重要的海产经济蟹类之一。本研究以日本蟳为实验材料，运用RACE技术首次克隆得到日本蟳CHH基因(CjCHH)的全长cDNA 序列；通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CjCHH的组织差异性表达情况；并且利用原核表达技术构建了CjCHH的重组表达质粒pET-CHH。本研究结果为进一步阐明CHH的生理功能，丰富和完善甲壳动物内分泌的调控理论提供了基础材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

日本蟳购自宁波镇海水产品市场。解剖，取其眼柄、脑、胸神经节、Y-器、精巢、卵巢、心脏、肝胰腺、肌肉、鳃10种组织快速冷冻于液氮中，放于-80 ℃冰箱保存备用。

Trizol、UNIQ-10柱式PAGE胶DNA回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、IPTG购自Sangon公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 购自Clontech公司；PrimeScript® RT reagent Kit (Perfect Real Time)、SYBR® PremixExTaqTM II、pMD18-T载体、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-28α质粒、NdeI和Hind III限制性内切酶、T4 DNA 连接酶及其它试剂均购自Takara公司。引物合成及测序均由Sangon公司完成。

1.2 CjCHH全长cDNA序列克隆

1.2.1 RNA的提取和cDNA的制备

解剖获得日本蟳眼柄组织，采用Trizol方法提取眼柄总RNA，并且通过电泳及紫外分光光度计对其进行检测。

用于3′ RACE的cDNA以AP(表1)为接头引物，用PrimeScript® RT reagent Kit (Perfect Real Time)反转录得到第一链cDNA；用于5′ RACE的cDNA按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit说明书合成。所有cDNA放于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 3′ RACE和5′ RACE

根据已经公布的CHH氨基酸序列，设计引物CHH3-F和CHH3-R(表1)。以3′RACE-cDNA为模板，CHH3-F和CHH3-R为上下游引物进行PCR。

根据3′ RACE测序结果，设计下游特异性引物GSP1和GSP2(表1)用于5′ RACE，以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit提供的5′ outer和5′ inner(表1)为上游引物，按说明进行两轮PCR。

1.2.3 PCR产物的克隆与测序

PCR产物经琼脂糖电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化，连入pMD18-T载体，转化至E.coliDH5α感受态细胞，所获得的阳性克隆由Sangon公司完成测序。

1.3 序列分析

测序结果用Vector NTI 7进行拼接，获得CjCHH全长cDNA序列；BLAST程序分析CjCHHcDNA和氨基酸序列；ORF Finder确定开放阅读框(ORF)。ProtParam tool 预测氨基酸物理参数；SignalP 4.1 Server 预测信号肽；SMART程序分析氨基酸结构。ClustalX进行多序列比对；MEGA 4.1构建系统进化树。

1.4 组织表达分析

提取日本蟳各组织RNA，反转录合成cDNA。根据CjCHH和日本蟳β-actin(JN033202)[15]序列分别设计特异性引物CHH-ZF、CHH-ZR和内参引物actin-F、actin-R(表1)，运用qRT-PCR检测不同组织中CjCHH的相对表达量；SPSS 17.0进行统计分析，P<0.05 表示差异显著。

1.5 原核表达分析

1.5.1 原核表达载体的构建

以反转录得到的cDNA为模板，用含NdeI和Hind III酶切位点的引物CHH-F-NdeI和CHH-R-Hind III(表 1)进行PCR。扩增产物与pMD18-T载体连接后转化至感受态E.coliDH5α进行培养。提取含CHH的pMD18-T载体进行NdeI和Hind III双酶切，酶切产物通过T4连接酶与经同样内切酶双酶切的pET-28α质粒连接，构建重组质粒pET-CHH。将其转化至E.coliDH5α进行培养，通过PCR验证获得阳性菌落。

1.5.2 pET-CHH蛋白的诱导表达

提取重组质粒pET-CHH，转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素的LB固体培养基中培养，菌液PCR筛选含有重组质粒pET-CHH的菌落。将筛选的菌落接种于含卡那霉素LB液体培养基，37oC震荡培养12 h。菌液经终浓度为1 mM的IPTG诱导，以诱导前样品为对照组，每隔1 h取出1组实验组，共5组。诱导结束后进行SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝G-250染色检测蛋白表达情况。

表1 引物序列

2 结果

2.1 CjCHH全长cDNA序列

将测序结果进行拼接，获得总长为1754 bp的CjCHH全长cDNA序列(图1)，该序列已在GenBank登陆，登录号为FJ768717。CjCHH全长cDNA序列包含5′UTR(111 bp)、ORF(423 bp，编码140个氨基酸)和3′UTR(1236 bp)，3′UTR cDNA片段含加尾信号AATAAA和Poly (A)。采用ProtParam软件预测CjCHH分子式为C678H1085N195O203S13，理论等电点为8.16。利用SignalP软件对编码区进行分析，发现CjCHH存在信号肽，长度为26个氨基酸残基，成熟肽长度为75个氨基酸残基，具有6个保守的半胱氨酸残基(Cys7，Cys23，Cys26，Cys39，Cys43和Cys52)。信号肽和成熟肽之间存在由37个氨基酸残基组成的CPRP和一个保守的位点KR。

2.2 序列比对和系统进化树分析

将推测的CjCHH氨基酸成熟肽序列与已公布的其它甲壳动物CHH进行BLAST检索分析，发现一致性为41%～88%。与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)一致性最低，为47%；与远海梭子蟹(Portunuspelagicus)一致性最高，为88%。与蓝蟹(Callinectessapidus)一致性为87%，拟穴青蟹一致性为84%，榄绿青蟹一致性为81%，克氏原螯虾(Procambarusclarkii)一致性为62%。进一步使用ClustalX软件，将CjCHH的氨基酸序列与拟穴青蟹(SpCHH，AFD28273.1)、榄绿青蟹(SoCHH，AQ75760.1)和远海梭子蟹(PpCHH，AFM29133.1)的CHH进行多序列比较。结果显示它们的氨基酸结构都包括信号肽、CPRP和成熟肽，其中成熟肽含有6个保守的Cys残基，可形成3个二硫键(图2)。

图1 CjCHH全长cDNA序列及编码氨基酸序列

单下划线表示CPRP和加尾信号；双下划线表示半胱氨酸残基所在位点(Cys)；阴影部分表示信号肽；方框表示切割位点KR；*表示终止子。

图2 多种CHH的氨基酸序列比对

阴影部分表明相同的氨基酸序列，阴影颜色的深浅分别表示相似程度的高低；*表示6个保守的半胱氨酸。

利用MEGA 4.1软件，将CjCHH与其它甲壳动物CHH的成熟肽序列通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。结果显示，蟹类CHH聚为一类，虾类CHH聚为一类，蟹类MIH聚为一类，CjCHH与其它梭子蟹科CHH聚在一起(图3)。

2.3 组织差异性表达分析

qRT-PCR结果显示，CjCHH在所检测的10个组织中均有表达(图4)。其中，在眼柄中表达量最高，肠和Y-器次之，其余组织表达量较低。

图3 系统进化树

ScyllaolivaceaCHH (SoCHH, AQ75760.1),ScyllaparamamosainCHH (SpCHH, AFD28273.1),PortunustrituberculatusCHH (PtCHH, ACB46189.1),PortunuspelagicusCHH (PpCHH, AFM29133.1),CallinectessapidusCHH (CsCHH, AAS45136.1),CharybdisjaponicaCHH (CjCHH, ACN87216.1),Carcinusmaenas(CmCHH, P14944.2),GecarcinuslateralisCHH A(GlCHH, ABF48652.1),HomarusamericanusCHH A (HaCHA , AAB32871.1),HomarusgammarusCHH A(HgCHH A, ABA42179.1 ),ProcambarusclarkiiCHH2 (PcCHH2, AFV95077.1),LitopenaeusvannameiCHH B(LvCHH B, AAN86055.1),MarsupenaeusjaponicusCHH (MjCHH, BAE78493.1 ),PandalopsisjaponicaCHH (PjCHH, AFG16933.1),MacrobrachiumrosenbergiiCHH (MrCHH, AAL40916.1),Macrobrachiumnipponense CHH (MnCHH, AEJ54624.1),CharybdisjaponicaMIH (CjMIH, ACD11361.1),ScyllaparamamosainMIH (SpMIH, AFM35653.1),PortunustrituberculatusMIH (PtMIH, ABZ04547.1).

图4 CjCHH的组织差异性表达

Es—眼柄； TG—胸神经节； Hp—肝胰腺； Ms—肌肉； Ht—心脏； Gi—鳃； In—肠； YO—Y-器； Te—精巢； Ov—卵巢； 不同字母表示差异显著(P< 0.05)。

2.4 原核表达分析

含有pET-CHH重组质粒的菌液经IPTG诱导后用SDS-PAGE电泳检测分析。结果显示，未经IPTG诱导的对照组菌液没有表达CHH重组蛋白，经IPTG诱导的菌液表达了CHH重组蛋白，且在相对分子质量约为11 kDa处出现了以包涵体形式表达的融合蛋白条带(图5)，与预测的相对分子质量大小相一致。在实验组中，诱导1 h(图5-2)的CHH重组蛋白表达量最少，诱导5 h (图5-6)的表达量最大，表达量随诱导时间的增加而增大。

图5 重组蛋白SDS-PAGE图谱

1—IPTG诱导前； 2—IPTG诱导1 h； 3—IPTG诱导2 h； 4—IPTG诱导3 h； 5—IPTG诱导4 h； 6—IPTG诱导5 h； M—蛋白标记。

3 讨论

CHH是一种多效型的神经肽，参与十足目甲壳动物多种生理过程的调控[10,16]。在甲壳动物中，已从美洲螯龙虾(Homarusamericanus)[17]、斑节对虾(Penaeusmonodon)[18]、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[19]、日本沼虾[14]和红眼雪蟹(Chionoecetesbairdi)[20]、可口美青蟹(Callinectessapidus)[21]、凡纳滨对虾[22]等物种中获得全长cDNA编码的CHH。研究表明，CHH成熟肽中的6个保守的Cys残基可形成3个链内二硫键[23]，且在第一个Cys残基后面第5位上没有CHH 家族II型肽中所特有的Gly残基[14]。本研究采用 RACE技术，获得了CjCHH全长cDNA序列(图1)。经序列比对分析，CjCHH与已知的其它甲壳类CHH同源，具有相似结构特征，均由信号肽、CPRP和成熟肽组成，在CPRP与成熟肽之间存在保守位点KR(图2)。系统进化树结果显示，虾蟹类CHH分别聚为一支，这与甲壳动物分类相符[24]；蟹类CHH与MIH分别聚为一支，距离较远，这符合CHH家族基因的分类[2]；本文所研究的CjCHH与它梭子蟹科物种CHH聚到一起，这与日本蟳所处的分类地位一致(图3)。

组织差异性表达结果显示，CjCHH在检测的10个组织中均有表达(图4)。在眼柄中CjCHH的表达量最高，这与日本沼虾[14]、可口美青蟹[21]的CHH组织表达结果一致，但在凡纳滨对虾中，CHH在心脏中表达量最高[22]，这可能由物种间差异导致也可能受其它因素的影响，具体原因尚待进一步探明。CjCHH在Y-器与肠中表达量较高，可能与CHH的多种生理功能相关。Zarubin等[24]研究发现，Y-器细胞膜中存在受体鸟甘酸环化酶，CHH通过与其结合，从而影响Y-器分泌蜕皮激素；在可口美青蟹的蜕皮前期，XO-SG复合体中CHH含量显著升高[21]。在日本沼虾中，CHH在精巢中的表达量是其在卵巢中表达量的250倍[14]，本研究中的CjCHH在精巢中的表达量略高于卵巢。这表明，甲壳动物的蜕皮调控除了受MIH与蜕皮激素的[21]相互拮抗调控外，CHH的协同调控作用同样不能忽视；CHH可能与甲壳动物雄性发育密切相关。

由于CHH天然蛋白存在量少，为了获得活体蛋白用于进一步的实验研究，通过原核表达等技术获得CHH活性蛋白是CHH功能研究的必须环节。近年来，通过原核表达技术已获得多种甲壳动物的CHH重组蛋白。如日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[25]、凡纳滨对虾[26]、橄绿青蟹[27]、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[28]等。本研究成功构建了pET-CHH重组质粒，可以在IPTG的诱导下大量表达CHH重组蛋白(图5)，为CjCHH的功能研究打下了深厚基础。

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