宋 波, 郭 佳, 袁华平, 关 锋
(1. 江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122 2. 江苏省昆山市疾病预防控制中心,江苏 昆山 215301)
糖生物学研究已成为21世纪生命科学的前沿和热点领域之一,而糖鞘脂的结构和功能是糖生物学研究的主要内容。糖鞘脂广泛分布于脑组织神经细胞的膜表面,具有促进神经再生、轴突生长、突触形成以及恢复神经支配等功能[1],是细胞膜表面脂筏的重要组成部分,对脂筏的形成和稳固有着重要作用,并能促使胆固醇在脂筏中偏向胞质一侧分布[2]。糖鞘脂还参与了细胞生长、增殖、分化、凋亡、黏附及信号转导等过程[3-6](图1)。最新研究[7]发现某些糖鞘脂参与了细胞癌变的重要过程——上皮间质转化(胚胎发育和恶性肿瘤发展的一个重要过程,细胞由正常的上皮细胞转变为间质细胞,迁移能力和侵袭能力得到显著增强)。
糖鞘脂四糖基脑酰胺Gg4是由糖链、长链脂肪酸和鞘氨醇(Sphingosine)的长链碱基3部分组成的两性分子,主要富集于细胞膜上不溶于Triton X-100的区域,在可溶于Triton X-100的膜组分中,Gg4也有表达,但表达量极少[8]。本课题组前期工作中用转化生长因子TGF-β处理NMuMG细胞使之发生EMT过程,发现Gg4显著下调,而在细胞培养液中添加Gg4可以显著抑制NMuMG细胞发生EMT,免疫共沉淀实验也证明Gg4与E-钙黏蛋白和β-连锁蛋白存在相互作用,从而提出Gg4可以巩固E-钙黏蛋白/β-连锁蛋白复合体的模型[9-12]。
图1 糖鞘脂的结构及生物学功能(Sen-itiroh Hakomori, PNAS, 2002)
本文以NMuMG细胞为研究对象,运用基因工程技术将鼠源β3GalT4基因的全长序列和沉默β3GalT4表达的shRNA分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro中,稳定转染NMuMG,构建β3GalT4过表达和β3GalT4沉默NMuMG细胞株,通过薄层层析和免疫印迹验证了在两个稳定转染细胞株中Gg4表达分别上调和下调,细胞迁移实验发现两株细胞的迁移能力分别降低和增强,证实Gg4在细胞迁移方面具有重要的生物学功能。
大肠杆菌 JM109、真核表达载体pcDNA3.1(+)和pSUPER-retro由本实验室保存;小鼠胸腺上皮细胞NMuMG来自于美国模式培养物集存库ATCC。
细胞RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒和Ultra SYBR Mixture Real-Time试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司;Rever Tra Ace-α-逆转录试剂盒和DNA 高效Ligase购于TOYOBO公司;限制性内切酶、DNA Ladder marker、DNA切胶回收试剂盒和纯化试剂盒购于Takara公司;DNA聚合酶购于天根生化科技有限公司;DMEM培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素溶液购于Life technologies公司;LipofectamineTM2000转染试剂购于Invitrogen公司;抗生素、胰岛素和氯金酸购于Sigma公司;糖脂标准品购于MATREYA公司;TKH7由美国Biomembrane研究所S. Hakomori教授惠赠;Westar Nova 2011显色液购于CYANAGEN公司;Goat anti-Mouse IgM-HRP购于Southern Biotech公司;HPTLC Silica gel 60 F254薄层层析板购于EMD Chemicals公司;DISCOVERY DPA-6S柱购于SUPELCO公司;MTT试剂购于烟台赛尔斯生物技术有限公司;引物合成及测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.2.1β3GalT4过表达和沉默真核表达载体的构建
通过PCR扩增鼠源β3GalT4基因CDS区(引物见表1),克隆至pcDNA3.1(+);根据RNA干扰原则在β3GalT4基因CDS区内设计合成3段靶序列(引物见表1),克隆至pSUPER-retro,分别转化JM109感受态细胞,筛选阳性转化子进行菌落PCR(引物见表1),并提取质粒后单、双酶切验证,阳性克隆经上海英潍捷基公司测序鉴定得到进一步确认。获得正确的重组质粒,分别命名为pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1, 2和3号。
表1 实验中的相关引物
1.2.2 细胞培养、转染及β3GalT4过表达和沉默细胞株的筛选
NMuMG细胞在含10%(v/v)胎牛血清、10 μg/mL胰岛素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基、37℃下含5%(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。参照LipofectamineTM2000说明书,将重组质粒pcDNA3.1(+)/β3GalT4和pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA 1, 2, 3号转染NMuMG细胞,培养24 h后分别加入终浓度600 μg/mL G418和4 μg/mL Puro筛选2周。挑取单细胞克隆扩大培养,Real-Time PCR及半定量PCR(引物见表1)筛选β3GalT4过表达和沉默的NMuMG单克隆细胞株。
1.2.3 糖鞘脂的提取
按文献[13]方法提取细胞糖鞘脂。提取后,将提取物上样DISCOVERY DPA-6S柱,用10倍柱床体积的ddH2O对样品进行脱盐处理后,加入2 mL氯仿/甲醇(v/v=2/1)洗脱并收集,提取物在氮气下吹干后加入200 μL氯仿/甲醇(v/v=2/1)复溶,用于后续实验。
1.2.4 薄层层析和免疫印迹分析糖鞘脂的表达差异
按文献[14]方法薄层层析分析糖鞘脂的表达。每一样品在硅胶板上对称点样2次,展层后切割硅胶板,一半用于地衣酚显色,另一半用于免疫印迹实验。Gg4免疫印迹:切割后,将硅胶板浸泡于1% BSA/PBS(w/v)中,室温震荡封闭30 min,加入Gg4抗体TKH7(TKH7∶1% BSA/PBS=1∶5, v/v),室温震荡孵育2 h后TBS-T清洗3次,每次5 min。加入HRP标记的IgM(IgM∶1% BSA/PBS=1∶5000, v/v),室温震荡1 h后TBS-T清洗3次,每次5 min。将底物试剂A和B等体积混合制备显色液淋洗硅胶板,暗室曝光拍照。
1.2.5 胶体金及MTT实验
胶体金实验:六孔板每孔加入2 mL过滤的1% BSA(w/v),室温孵育3 h后吸出BSA,无水乙醇清洗1次,室温干燥1 h。按文献[15]方法配制胶体金悬液。六孔板每孔加入2 mL胶体金悬液,室温沉淀40 min后弃上清,用无血清培养基清洗1次,加入2 mL细胞悬浊液(每孔约1500个细胞),37℃培养18 h,拍照分析细胞迁移。
MTT实验:24孔板每孔接2×104个细胞,37℃分别培养20 h、40 h和60 h后加入20 μL MTT试剂,37℃孵育4 h,弃上清,每孔加入700 μL DMSO,混匀后,取200 μL至96孔板中,测OD595分析细胞增殖。
依照实验方法筛选转化子提取质粒后进行EcoR I、XhoI双酶切和EcoR I单酶切验证。双酶切后2个片段分别为1.1 kb和5.4 kb(泳道2),单酶切后片段大小为6.5 kb(泳道3),符合实验设计的预期大小。基因测序结果也与Genebank中鼠源β3GalT4序列完全一致,表明pcDNA3.1(+)/β3GalT4表达载体构建成功(图2)。
图2 重组表达载体pcDNA3.1(+)/β3GalT4的酶切验证
1—DL2000 DNA Marker;2—重组质粒双酶切;3—重组质粒单酶切;4—1 kb DNA Marker。
以pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号为例。筛选转化子菌落PCR、EcoR I和XhoI双酶切及BglⅡ单酶切验证。pSUPER-retro和转化子菌落PCR扩增片段分别为240 bp(泳道2)和300 bp(泳道3),双酶切片段大小分别为238 bp(泳道4)和298 bp(泳道5);pSUPER-retro单酶切后被切开(泳道6),转化子由于插入shRNA序列致使BglⅡ酶切位点发生改变而不能被切开(泳道7),结果与预期的实验设计相符。基因测序证实pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号表达载体构建成功(图3)。
图3 重组表达载体pSUPER-retro/β3GalT4 shRNA1号菌落PCR及酶切验证
1—50 bp DNA Marker;2—pSUPER-retro PCR;3—转化重组质粒的JM109菌落PCR;4—pSUPER-retroEcoR I和XhoI双酶切;5—重组质粒EcoR I和XhoI双酶切;6—pSUPER-retroBglⅡ单酶切;7—重组质粒BglⅡ单酶切;8—1 kb DNA Marker。
通过Real-Time PCR筛选β3GalT4过表达NMuMG细胞株。对比转染空质粒的NMuMG细胞,编号2-7-2和2-7-5细胞株的2-△△CT值分别为7.12和8.42,P-value均为0.001(图4A),表明2株细胞中β3GalT4显著上调。2-7-5细胞株半定量PCR验证:以tubulin作对照(泳道4和5),2-7-5细胞株(泳道3)β3GalT4表达水平显著高于转染空质粒NMuMG细胞株(泳道2)图4B。结果表明:筛选到的2-7-5细胞株为β3GalT4过表达NMuMG细胞株。
图4 Real-Time PCR和半定量PCR筛选β3GalT4过表达细胞株
A—编号2-7-2和2-7-5细胞株Real-time PCR; B—编号2-7-5细胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker;2—转染空质粒NMuMG细胞β3GalT4 PCR;3—编号2-7-5细胞株β3GalT4 PCR;4—转染空质粒NMuMG细胞tubulinPCR;5—编号2-7-5细胞株tubulinPCR。
通过Real-Time PCR筛选β3GalT4沉默NMuMG细胞株:对比转染空质粒的NMuMG细胞,编号1-1和2-3细胞株的2-△△CT值分别为0.575和0.950,P-value分别为0.0002和0.063(图5A),表明1-1号细胞株β3GalT4表达下调。1-1细胞株半定量PCR验证:以tubulin作对照(泳道4和5),1-1细胞株(泳道3)β3GalT4表达水平低于转染空质粒NMuMG细胞株(泳道2)(图5B)。结果表明:筛选到的1-1细胞株为β3GalT4沉默NMuMG细胞株。
图5 Real-Time PCR和半定量PCR筛选β3GalT4沉默细胞株
A—编号1-1和2-3号细胞株Real-time PCR;B—编号1-1号细胞株半定量PCR。1—DL2000 DNA Marker;2—转染空质粒NMuMG细胞β3GalT4 PCR;3—1-1细胞株β3GalT4 PCR;4—转染空质粒NMuMG细胞tubulinPCR;5—1-1细胞株tubulinPCR。
标品5 μL、样品30 μL点样于硅胶板上。薄层层析实验表明NMuMG细胞过表达β3GalT4 后Gg4表达上调(图6A),沉默β3GalT4后Gg4表达下调(图6B);免疫印迹实验证实NMuMG细胞过表达β3GalT4后 Gg4显著上调(图6C),沉默β3GalT4后细胞株Gg4表达下调(图6D)。实验结果证实:过表达和沉默NMuMG细胞β3GalT4后 Gg4分别显著上调和下调。
图6 β3GalT4过表达、沉默和NMuMG细胞株Gg4薄层层析及免疫印迹
A)β3GalT4过表达和NMuMG细胞株糖鞘脂薄层层析;B)β3GalT4沉默和NMuMG细胞株糖鞘脂薄层层析;C)β3GalT4过表达细胞株的Gg4免疫印迹;D)β3GalT4沉默细胞株的Gg4免疫印迹。
图7 过表达和沉默Gg4对NMuMG细胞水平的影响
A—细胞照相(×100倍); A上—细胞形态; A下—细胞迁移;B— 细胞迁移;C—细胞增殖。
对Gg4过表达、沉默及NMuMG细胞株培养24 h显微照相观察。转染株细胞形态与NMuMG相比无明显变化(图7A)。胶体金检测细胞迁移表明:过表达Gg4后,NMuMG细胞迁移能力明显降低;沉默Gg4后,NMuMG细胞迁移能力略有增加(图7A、B)。将3种细胞株以相同接种量分别培养20 h、40 h和60 h,通过MTT实验检测细胞增殖情况,结果表明过表达和沉默Gg4对NMuMG细胞增殖都没有显著影响(图7C)。
对糖鞘脂Gg4的研究报道并不多,这可能与Gg4在细胞中定位和表达量有关。已有报道证明Gg4分布于Hela细胞和小鼠自然杀伤细胞膜表面的脂筏区域,当巨噬细胞和T细胞被激活后,自然杀伤细胞中的Gg4表达显著增高[16]。Feldman等人发现绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的鞭毛蛋白可以结合宿主细胞膜上的Gg4,从而逃逸宿主细胞反应[17]。Gg4和Toll样受体5(Toll-like receptor 5)互相作用,介导钙离子的瞬间流入和ATP从细胞内的释放,而流入的钙离子导致了胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路的激活[18]。
本研究利用基因工程技术将β3GalT4在NMuMG细胞中过表达及沉默,构建了β3GalT4过表达和沉默NMuMG永久转染细胞株。在β3GalT4过表达转染株中,Gg4的表达显著增加,细胞迁移能力降低,而在β3GalT4沉默的细胞株中,Gg4的表达下降,细胞迁移能力升高(图6和7),证实了Gg4具有抑制细胞迁移的生物学功能。结合课题组前期的研究结果,Gg4可以巩固E-钙黏蛋白和β-连锁蛋白的相互作用,增加细胞粘附,这也可能是Gg4抑制细胞迁移的原因。此外,实验中运用基因沉默技术抑制β3GalT4基因的表达,效率约50%,若采用基因敲除技术彻底抑制Gg4的表达,可深入研究Gg4与其他蛋白或者受体相互作用、Gg4在膜上的定位以及对相关信号通路的影响。
总之,本实验结果证实Gg4在抑制细胞迁移方面具有重要作用,鉴于细胞粘附和迁移对癌症发生发展尤其是EMT过程具有重要意义,因此,本研究为Gg4在EMT过程中功能的行使提供了力证。另外,实验构建的Gg4过表达和沉默永久转染NMuMG细胞株可为研究Gg4巩固E-钙黏蛋白/β-连锁蛋白复合体的分子机制提供良好的细胞模型,也可为进一步探索其新的功能做出贡献。
参考文献:
[1]Meng Q, Di J. Ganglioside GM1 in treating acute cerebral infarction[J]. Chin J New Drugs Clin Rem, 2003, 22(1): 19-21.
[2]Sonnino, Mauri L, Chigorno V, et al. Gangliosides as components of lipid membrane domains [J]. Glycobiology, 2007, 17(1): 1-13.
[3]Aberle H, Schwartz H, Kemler R. Cadherin-catenin complex: protein interactions and their implications for cadherin function [J]. J Cell Biochem, 1996, 61(4): 514-523.
[4]Allende M L, Proia R L. Lubricating cell signaling pathways with gangliosides [J]. Curr Opin Struct Biol, 2002, 12(5): 587-592.
[5]Bremer E G, Schlessinger J, Hakomori S I. Ganglioside-mediated modulation of cell growth. Specific effects of GM3 on tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor [J]. J Biol Chem, 1986, 261(5): 2434-2440.
[6]Brown D A, London E. Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes? [J] Biochem Biophys Res Commun, 1997, 240(1): 1-7.
[7]Xu J, Lamouille S, Derynck R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition [J]. Cell Res, 2009, 19(2): 156-172.
[8]Abulrob A, Lu Z, Brunette E, et al. Near-field scanning optical microscopy detects nanoscale glycolipid domains in the plasma membrane [J]. J Microsc, 2008, 232(2): 225-234.
[9]Guan F, Handa K, Hakomori S I. Regulation of epidermal growth factor receptor through interaction of ganglioside GM3 with GlcNAc of N-linked glycan of the receptor: demonstration in ldlD cells [J]. Neurochem Res, 2011, 36(9): 1645-1653.
[10]Guan F, Shaffer L, Handa K, et al. Functional role of gangliotetraosylceramide in epithelial-to-mesenchymal transition process induced by hypoxia and by TGF-{beta} [J]. FASEB J, 2010, 24(12): 4889-4903.
[11]Daniotti J L, Martina J A, Zurita A R, et al. Mouse beta 1,3-galactosyltransferase (GA1/GM1/GD1b synthase): protein characterization, tissue expression, and developmental regulation in neural retina [J]. J Neurosci Res, 1999, 58(2): 318-327.
[12]Miyazaki H, Fukomoto F, Okada M, et al. Expression cloning of rat cDNA encoding UDP-galactose: GD2 beta1,3-galactosyltransferase that determines the expression of GD1b/GM1/GA1 [J]. J Biol Chem, 1997, 272(40): 24794-24799.
[13]Stapleton A, Nudelman E, Clausen H, et al. Binding of uropathogenicEscherichiacoliR45 to glycolipids extracted from vaginal epithelial cells is dependent on histo-blood group secretor status [J]. J Clin Invest, 1992, 90(3): 965-972.
[14]Bodennec J, Pelled D, Futerman A H. Aminopropyl solid phase extraction and 2D TLC of neutral glycosphingolipids and neutral lysoglycosphingolipids [J]. JLR, 2003, 44(1): 218-226.
[15]Geerts H, Brabander M, Nuydens Y, et al. Nanovid tracking: a new automatic method for the study of mobility in living cells based on colloidal gold and video microscopy [J]. Biophysical J, 1987, 52(5): 775-782.
[16]Masataka M I, Yoshitaka N, Okumura K, et al. A glycolipid on the surface of mouse natural killer cells [J]. European Journal of Immunology, 1980, 10(3): 175-180.
[17]McNamara N, Khong A, McKemy D, et al. ATP transduces signals from ASGM1, a glycolipid that functions as a bacterial receptor [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(16): 9086-9091.
[18]Du J W, Zhang F, Capoe-Aponte J E, et al. AsialoGM1-mediated IL-8 release by human corneal epithelial cells requires coexpression of TLR5 [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47(11): 4810-4818.