IL28B基因多态性检测的质粒标准品构建

王从阳

(华侨大学生物医学学院， 福建 泉州 362021)

丙型肝炎(Hepatitis C infection)是一种感染性疾病，严重危害着人类的健康，并且其流行趋势呈世界性分布。跟据WHO统计的数据，在全球范围内大约有1.7亿丙型肝炎病毒(Hepatitis C infection，HCV)感染者[1-2]。在中国，大约有3800万HCV感染者，其感染率约为3.2%，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例[3]。

研究表明[4-5]，丙型肝炎的治疗方式与治疗效果与病毒基因型密切相关，基因型1和基因型4的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林(PegIFN/RBV)联合治疗48周；基因型2和基因型3的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林(PegIFN/RBV)联合治疗24周。另有研究表明[2]，除了病毒方面的因素(基因型、HCV RNA水平)外，患者自身的因素也能对抗病毒治疗效果进行预测，其中IL28B多态性是一个重要的预测因子[6-7]。

IL28B基因位于第19号染色体短臂(19q13)，编码干扰素λ(IFN-λ-3)参与抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞的数量。可以由病毒感染等诱导产生并且在人上皮细胞等细胞中产生[7]。IL28B基因有多种SNPs，像SNP rs12979860，SNP rs8099917，SNP rs12980275，还有最新发现的SNP rs469415590[8]。而通过全基因组相关性研究(GWAS)发现，位于其附近的SNP rs12980275多态性与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗的效果具有显著相关性[9]。目前研究者将不同的IL28B相关的SNP基因型称为保护性和非保护性基因型[10]，保护性SNP基因型携带者治疗后获得SVR的几率高于非保护性基因携带者，对于rs12980275来说，A/A为保护性，G/A或者G/G为非保护性基因型，其中，A/A与1型HCV RVR[11]和SVR[12]密切相关，但对2或3型HCV患者并没有预测价值。在汉族人群中， HCV的自发清除与SNP rs12980275 A/A基因型也有很大关系[13]。同时，SNP rs12980275 的A/A基因型对HBeAg阳性的慢性乙肝患者来说也是保护基因型[14]。

IL28B基因多态性是目前为止GWAS发现用于个性化临床治疗的最好典范之一[2, 9, 15-16]。因此，为了获取可靠的检测结果，构建IL28b基因rs12980275位点的质粒标准品非常必要。

1 材料与方法

1.1 材料

外周血样本16份。按照IL28B基因组DNA序列，利用Primer Primier 5.0和Oligo 6软件设计、评价引物，目的片段大小为334 bp，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：F为5′-GGTGTTTGCTACATTGTTCGGCA-3′，R为5′-TTGGGCAACAAGAGCGAAACT-3′。 pGM-T载体、大肠埃希菌DH5α；琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。外周血DNA提取试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与扩增

外周血DNA的提取采用Wizard®基因组DNA纯化试剂盒。DNA提取后，用F和R引物进行PCR反应，反应体系为：mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 21 μL，总体积50 μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。然后进行琼脂糖凝胶电泳回收。

1.2.2 PCR产物的克隆

PCR产物的回收：在紫外灯下将PCR产物回收，切出含有目的DNA片段(334 bp)的琼脂糖凝胶，操作过程中要求尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，然后按琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒说明进行回收。

PCR产物的克隆： T载体在冰上融化，连接反应液为pGM-T Vector 1 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、PCR产物4 μL，总体积10 μL，于16℃连接过夜，目的基因IL28B rs12980275片段克隆至pGM-T Vector上，然后进行转化实验，至大肠埃希菌DH5α中，在含有氨苄的LB培养基上涂布，37℃下倒置培养12～16 h，形成单菌落。挑选白色菌落，用菌落PCR鉴定。并按质粒DNA纯化试剂盒提取质粒DNA。用紫外分光光度计测定质粒纯度及浓度，质粒DNA的OD260/OD280为1.6～1.8。送上海生工生物工程有限公司测序，采用Blast分析结果。

1.2.3 重组质粒标准品的制备

将重组质粒标准品原液稀释成0.01～10 ng/μL 4个梯度的标准品，然后进行PCR扩增并送上海生工生物工程有限公司测序。量取同体积同浓度的野生纯合质粒和突变纯合质粒混匀，进行PCR扩增后并送上海生工生物工程有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 序列下载及突变位点确定

IL28B基因位于19号染色体，SNP rs12980275则位于IL28B基因下游2.4 kb处，该位点碱基野生型为A，突变型为G。

2.2 引物验证

将设计好的引物进行Blast比对，特异性良好。以16个gDNA样本为模板，通过PCR扩增，获得IL28B基因rs12980275片段的序列、大小约334 bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果与期望值一致，如图1。目的条带清晰单一，说明所设计引物适用。

M—DL500 DNA Marker； 1-16—样本序列号； “-”—空白对照(检测到条带位于marker条带的300 bp和400 bp之间)。

图1引物验证电泳图

Fig 1 Primers tested by electrophoresis

2.3 标准品制备的DNA样本筛选

将扩增成功的16管PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司测序。对各个序列进行比较，选出IL28B rs12980275位点为碱基AA和GG的样本作为标准品制备DNA样本。

从16个样本的测序结果发现，AA型样本有12个，AG型样本3个，GG型样本1个(见图2)。

(箭头指示位置为SNP rs12980275位点)

2.4 连接转化结果

利用天根pGM-T克隆试剂盒，连接转化IL28B rs12980275位点为碱基AA和GG的对应PCR产物片段，得到相应的转化平板(如图3)。

(白色菌落为转化成功菌落)

图4 菌落PCR电泳图

1-3—AA型菌落； 4-6—GG型菌落； “-”—空白对照； M—DL500 DNA Marker(检测到条带位于marker条带的300 bp和400 bp之间)。

用灭菌的牙签挑取白色菌斑，以引物F和R进行菌落PCR实验，AA和GG两种基因型的转化平板上各挑取3个菌落，并做好对应标记。菌落PCR电泳结果如图4，片段长度334 bp左右，证实片段连接正确。

2.5 质粒标准品构建结果

将经菌落PCR检测为阳性的AA型菌落1和GG型菌落4接种到10 mL LB(含有100 μg/mL的氨苄青霉素)培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测提取结果(图5)。

1—AA型质粒; 2—GG型质粒; M—DL500 DNA Marker

图5质粒提取电泳图

Fig 5 Result of plasmid electrophoresis

将提取的质粒送上海生工测序，结果如图6和图7，碱基序列正确。与GenBank进行BLAST比较，结果(图8)表明：插入片段全长为334 bp，与GenBank号为AC011445.6的序列100%一致。

(箭头指示位置为SNP rs12980275位点)

图6 AA型质粒标准品测序报告

Fig 6 Result of sequence detected by standard plasmid sample 6AA

(箭头指示位置为SNP rs12980275位点)

图7 GG型质粒标准品测序报告

Fig 7 Result of sequence detected by standard plasmid sample 7GG

2.6 质粒标准品稀释试验以及混合试验结果

将质粒标准品稀释成0.01～10 ng/μL 4个梯度进行PCR扩增，结果如图9，质粒浓度0.01 ng/μL时，扩增条带不明显；质粒浓度达0.1 ng/μL甚至更高时，可得到单一的清晰条带。送样测序结果也显示，质粒浓度达0.1 ng/μL时，才可成功获取清晰的测序图谱。0.1 ng/μL 的质粒在-20℃冻存6个月试验结果稳定。

(红色标记位置为SNP rs12980275位点)

图8 AA型(左)和GG型(右)序列Blast比对结果

Fig 8 Comparison of type AA with type GG by Blast N

M—DL500 DNA Marker; “-”—空白对照; 1-4—0.01～10ng/μL(检测到条带位于marker条带的300 bp和400 bp之间)。

图9质粒稀释PCR电泳图

Fig 9 Result of diluted PCR electrophoresis

量取同体积的0.1 ng/μL野生纯合质粒和突变纯合质粒，混匀，进行PCR扩增测序，成功得到rs12980275位点杂合突变的序列图谱(图10)。

(箭头指示位置为SNP rs12980275位点)

图10 AA型和GG型质粒标准品1∶1混合的测序报告

Fig 10 Sequence detected by the mixture of standard plasmid samples of type AA and type GG with a ratio of 1∶1

3 讨论

在本研究中，先将PCR产物克隆到载体上，然后抽提质粒，最后成功构建了检测IL28B rs12980275位点突变的标准品，该标准品具有纯度高、易于保存、分型准确等优点，可长期用于检测。该标准品在-20℃条件下具有良好的稳定性。经过毛细管电泳测序，证明该标准品为IL28B基因上包含rs12980275位点序列的特异性产物。对不同浓度的质粒模板进行扩增测序的实验结果分析，质粒浓度达0.1 ng/μL时，PCR扩增即可得到单一的清晰条带，-20℃冻存6个月试验结果稳定。同体积的0.1 ng/μL野生纯合质粒和0.1 ng/μL突变纯合质粒混匀，PCR扩增送测序可得到清晰的rs12980275杂合突变序列图谱。

鉴于IL-28b基因多态性可预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果等的临床价值[17]，各国已开始重视该基因的检测[15]。本研究中IL28B rs12980275位点AA(野生型)、GG(纯合突变)和AG(杂合突变)3种质粒标准品的成功构建，对以后该试剂盒研发工作的开展是一项有力保障。

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