雷公藤多甙对EAE大鼠脊髓β－APP和IL－17表达的影响

周发明 李小丽 陈光辉

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特征的自身免疫性疾病。研究表明IL－23／IL－17轴在MS发生、发展中起重要作用［1］。IL－17是IL17家族的代表性因子，能诱导多种致炎性细胞因子的产生，促进炎症反应和自身免疫性疾病的发生。随着研究的深入，人们发现MS早期即出现轴索损伤［2］，这可能是MS患者反复发作后部分神经功能无法完全恢复的原因。β－APP是轴索损害的一个敏感指标［3］，通过对β－APP的检测可以判断轴索损伤的程度和范围，保护MS的轴索损伤已成为主要的研究方向。雷公藤多甙已在临床广泛运用于治疗免疫性疾病，但雷公藤多甙对EAE大鼠的保护作用机制如何，相关报道并不多见。本研究通过雷公藤多甙对实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）大鼠进行干预，并对大鼠的发病率、发病后神经功能评分、中枢神经组织病理变化以及β－APP、IL－17等指标进行研究分析，以探讨雷公藤多甙对EAE作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 6～8周龄雌性Wistar大鼠30只，体重约180～200 g（学校实验动物中心提供）。卡介苗冻干粉购自上海生物制品研究所；IL－17试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；兔抗大鼠β－APP多克隆抗体购自北京中杉金桥；SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；雷公藤多甙片（TWP）为黄石飞云制药有限公司生产（Z42021312）。

1.2 EAE模型的建立及评分 等量的豚鼠脊髓匀浆和含8 mg／ml卡介苗的完全福氏佐剂（CFA）混合为免疫抗原，Wistar大鼠按0.5 ml／只分别于大鼠后足垫及背部皮下注射免疫抗原，诱导EAE模型［4］。于豚鼠免疫后每天对豚鼠进行神经功能评分。采用Hooper的7分评分标准，即0分：正常；1分：被毛不光整，尾部无力；2分：尾部瘫痪；3分：尾部瘫痪＋后肢无力；4分：尾部瘫痪＋后肢部分瘫痪；5分：后肢完全瘫痪；6分：四肢瘫痪；7分：濒死状态或死亡［5］。

1.3 分组及给药 将大鼠随机分成3组即（1）空白对照组（CON组，n＝10）：相同条件和环境中饲养，不作任何处理，用于反映正常生理状态；（2）模型组（EAE组，n＝10）：使用豚鼠脊髓匀浆与CFA混合抗原乳剂诱导大鼠建立EAE模型，并予生理盐水1.5 ml／只灌胃，1次／d，连续14 d；（3）治疗组（TWP组，n＝10）：使用豚鼠脊髓匀浆与CFA混合抗原乳剂诱导大鼠建立EAE模型，将雷公藤多甙片溶于生理盐水中，以剂量20 mg／kg灌胃，1次／d，连续14 d。

1.4 HE染色 于建模后14 d（此时接近EAE模型发病的高峰期）处死大鼠，取脊髓中腰膨大部分，放入4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，苏木素－伊红（HE）染色，将切片在光学显微镜下进行观察，观察组织中血管周围炎性细胞浸润情况，并记数血管周围袖套数目，3张切片上血管袖套数目取平均值（病理评分）进行统计分析。

1.5 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水，抗原修复液修复等行β－APP、IL－17免疫组织化学染色。结合HE染色，将免疫组织化学染色完毕的切片在光学显微镜下观察，按顺序计数每张切片脊髓内5个400倍视野下阳性细胞个数，细胞的表达以该片阳性细胞数／5表示，然后取3张切片的平均值表示该组表达水平。

1.6 统计学处理 实验数据采用均数±标准差（¯x±s）表示，2组间计量资料比较用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。使用SPSS13.0统计软件。

2 结 果

2.1 大鼠发病情况及神经功能评分 空白对照组大鼠活动正常，无1例出现EAE症状；大鼠造模后EAE组第9 d开始发病；TWP组第11 d开始发病。发病大鼠均以尾部远端张力下降、爬行时尾尖下垂为首发症状，继而出现步态摇摆，进而出现全尾瘫痪、拖地，后肢无力、瘫痪等症状，部分合并前肢瘫痪，甚至濒死。CON组大鼠平均神经功能评分为0，无临床症状。EAE组与TWP组2组间发病率和潜伏期无明显差异。TWP组较EAE组平均神经功能评分降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠EAE发病情况

2.2 大鼠脊髓HE染色

CON组大鼠脊髓HE染色均匀，无炎性细胞浸润（图1）；EAE组大鼠脊髓白质内炎性灶多见，以小血管为中心并可见中心小血管扩张，管周由大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，也可见胶质细胞及一定数量的巨嗜细胞浸润环绕，形成“袖套”样改变（图2），病理评分为（2.09±0.91）分。TWP组炎性细胞浸润及血管“袖套”明显减少，病理评分为（1.05±0.36）分。TWP组病理评分较EAE组降低（P＜0.05）。

2.3 大鼠脊髓β－APP、IL－17表达水平

各组内均可见明显阳性细胞表达，表现为细胞浆着色，呈黄褐或黄色，不均匀散在分布。与EAE组比较（表2，图3～6），TWP组大鼠组织中β－APP、IL－17表达水平均降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠β－APP、IL－17的表达水平（¯x±s，个／每400倍视野）

图1 CON组大鼠腰髓，未见炎症细胞浸润（HE染色×100倍） 图2 EAE组第14 d大鼠腰髓，炎症细胞浸润，血管袖套形成（HE染色×100倍）

图3 EAE组β－APP表达水平（×400倍） 图4 TWP组β－APP表达水平（×400倍）

图5 EAE组IL－17表达水平（×400倍） 图6 TWP组IL－17表达水平（×400倍）

3 讨 论

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与人类多发性硬化（M S）的病理变化极其相似，是研究多发性硬化的经典动物模型，其病因、发病机制目前仍不十分明确。近来研究表明IL－23／IL－17轴在MS发生、发展中起重要作用。IL－17是由IL－23诱导生成的Thl7细胞分泌，IL－17家族的代表性因子，能诱导多种致炎性细胞因子的产生，如IL－6、肿瘤坏死因子1和一氧化氮合酶等，促进炎症反应和自身免疫性疾病的发生。有研究在EAE发病前检测外周淋巴细胞内即有显著升高，发病高峰期外周淋巴细胞内IL－17表达不明显，但在CNS中可以检测到高水平的IL－17生成，可能是由于发病高峰期Thl7细胞主要转移至CNS所致［6］。梁军利等的研究检测到复发缓解型MS（RR－MS）患者血清和脑脊液IL－17水平较神经系统非炎症疾病患者明显增高，提示IL－17与MS的发病密切相关［7］。Kebir等发现MS患者血脑屏障（BBB）内皮细胞表达IL－17和IL－22受体，并且体内外IL－17和IL－22均可以诱导BBB内皮细胞表达CCL2，CCL2与Thl7细胞表面相应的趋化因子受体结合后破坏紧密连接，有效地通过BBB进入中枢神经系统，也参与诱导EAE的发生［8］。在IL－17基因敲除小鼠对EAE不敏感，表现为发病延迟且恢复更早，EAE严重程度评分和病理改变都明显减轻［9］，提示IL－17在MS（和EAE）的发生、发展过程中具有重要作用。

近来对MS研究发现，单纯的炎症和脱髓鞘已经不能完全解释患者的神经功能障碍，在MS早期以炎症反应为主的阶段非脱髓鞘损害就已存在，而后者是MS功能障碍进展的重要原因［10］。轴索损伤是影响患者治疗和康复的重要因素，轴索损害越重MS患者的预后越差［11］。越来越多的证据支持轴索损伤在多发性硬化中的重要性，目前轴索损伤的依据主要来自于病理学和神经影像学两个方面。在病理学方面Trapp的研究结果表明，在MS发病过程中不仅发生了脱髓鞘改变，轴索也受到了损伤［12］。Amold通过MRI研究发现，一些MS患者的神经元轴突方向上有一种非炎症性的病理损害，表明与炎性细胞浸润、脱髓鞘无关的神经损害机制可能参与了MS的发病［13］。只有轴突甚至神经元受到损害才能解释这些不可逆的神经障碍，所以可能存在某种有害因素绕过了髓鞘而直接损害神经元。β－淀粉样前体蛋白（β－Amyloid Precursor Proteinβ－APP）是一种广泛存在于全身组织，具有膜受体蛋白样结构的单跨膜蛋白。β－APP作为轴索损害的一个敏感指标，通过对β－APP的检测可以判断轴索损伤的程度和范围。据报道用免疫组织化学的方法对多发性硬化病变组织的β－APP进行了检测，表明急性多发性硬化、慢性活动期等病变组织有较多的β－APP沉积，因为早期轴突的轴浆运输功能障碍导致β－APP的沉积［14］，以上结果表明从定性定量的角度证实在EAE中确实存在轴索损伤，且随病情活动β－APP的表达量呈动态变化。国内也有研究表明，EAE模型组大鼠中枢β－APP蛋白的表达高于对照组，差异有统计学意义［15］。Ghosh等通过免疫染色检测β－App已经在MS急性脱髓鞘病灶中证实存在实质性轴索损伤，同时发现在部分其他急性脱髓鞘疾病中也会出现相同情况［16］。轴突的损伤与浸润的CD8＋的细胞毒性T淋巴细胞有关。Owens等人发现MS早期广泛轴突损伤的范围和中枢神经系统内CD8＋T淋巴细胞的数量存在相关关系［17］。提示在强调由炎症引发的髓鞘脱失导致继发的神经元损害的同时，各种有害因素对神经元的直接破坏作用也不可忽视。有关MS的研究中在围绕如何减轻炎性反应、保护髓鞘的同时，也应该重视对轴索的保护。

雷公藤多甙具有抗炎、抗免疫、抗肿瘤等多种活性，已在临床广泛运用［18］。郑和忠等的实验表明雷公藤多甙能明显减轻EAE大鼠发病病情和延缓发病时间［19］。近年来又有研究发现雷公藤多甙还具有神经保护功能［20］。本研究给予TWP干预治疗后在EAE模型大鼠发病高峰期可观察到TWP能减轻EAE大鼠临床症状，减少EAE发病。TWP组炎性细胞浸润及血管“袖套”明显减少，病理评分为（1.05±0.36）分。TWP组病理评分较EAE组降低，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。免疫组化法检测与EAE比较，TWP组大鼠组织中β－APP阳性表达水平降低，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；IL－17水平也较EAE组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。本实验表明TWP干预使大鼠EAE的发生明显受到抑制，EAE严重程度评分和病理改变都明显减轻。因此，认为TWP对EAE大鼠有保护作用，且这种作用可能与TWP降低β－APP、IL－17表达，减轻轴索损伤和炎性细胞活性有关。

本实验提示TWP可干预EAE中β－APP、IL－17的表达，从而可能对EAE起到一定的治疗作用，这为我们探讨MS发病及治疗提供了新的前景。

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