芪灵合剂对慢性乙型肝炎患者T细胞表面程序性死亡1和程序性死亡配体1表达的影响*

孟庆宇 施维群 倪 伟 陆增生 何 创 黄灵跃

1.浙江中医药大学(浙江 杭州，310038) 2.浙江中医药大学附属第二医院

HBV 持续感染的主要免疫学特征是病毒特异性CD4+T 细胞和CD8+T 细胞不同程度的低应答状态，多项研究［1，2］证实，PD-1/PD-L1 高表达可能导致特异性T 细胞功能衰竭，增殖活性降低，细胞因子尤其是IFNγ，TNFα，IL-2 等产生不足，导致非细胞毒性病毒清除能力下降。因此通过阻断或下调PD-1/PDL1 表达，使功能衰竭的特异性CD8+T 细胞功能恢复，从而促进HBV 清除，不失为治疗CHB 的一个重要途径。

我们在核苷(酸)类似物抗病毒的基础上，增添中药芪灵合剂的干预，对CHB 治疗的临床疗效可以在HBV DNA 转阴率、ALT 复常率等体现优势。既往的研究也证实，芪灵合剂中黄芪、仙灵脾具有一定的抗病毒和调节免疫的作用。现通过芪灵合剂干预的CHB 患者外周血CD4+T 细胞表面PD-1/PD-L1 表达的研究，认识到CHB 免疫治疗与抗病毒一样不可或缺。

1 资料与方法

1.1 临床资料 56 例CHB 患者来自2012年8 月-2013年12 月浙江中医药大学附属第二医院的住院及门诊患者，年龄18～60 岁，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010 版)的标准:既往有乙型肝炎病史或HBsAg 阳性超过6 个月，现HBsAg 和(或)HBV DNA仍为阳性者，HBV DNA 阳性(HBV DNA≥104拷贝/m1)，ALT ＞2 ×ULN。自愿参加本试验并接受随访和各项必要的检查。患者采用自愿服用的原则，分设芪灵合剂联合LAM 治疗组(以下称治疗组)和单用LAM 对照组(以下称对照组)。排除标准:甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染者，失代偿性慢性肝病，有自身免疫性疾病史，妊娠及哺乳期患者，有严重器质性疾病、精神病、嗜酒、吸毒、肝毒性药物使用史，近期使用核苷(酸)类药物和干扰素等抗病毒药物或免疫调节剂。两组患者基线情况比较，见表1。

表1 两组患者基线比较(±s)

表1 两组患者基线比较(±s)

1.2 治疗方法 治疗组患者给予芪灵合剂(其中黄芪和仙灵脾的配伍比例为2∶1，浓缩为中药合剂，以100ml 分装，相当于生药分别为30g 与15g，1 剂/d，分2 次口服)，口服LAM (100mg/d);对照组仅口服LAM (100mg/d)。LAM 片为葛兰素史克中国公司生产，芪灵合剂为院内自制制剂。

1.3 检测指标 检测患者治疗前基线，治疗24 周和48 周时血清ALT 水平、HBV DNA 水平、HBV-M、CD4+T 淋巴细胞及其表面PD-1/PD-L1 的表达。

1.4 主要试剂和仪器 肝功能用日本Olympus AU 2700 全自动生物化学分析仪检测;乙肝三系检测采用酶联免疫吸附法，试剂购自上海科华生物工程股份有限公司。HBV DNA 定量检测采用美国PE5700 实时荧光定量PCR 法检测，最低检测下限为103copies/ml。流式细胞仪购自美国Beckman Coulter 公司，型号为EPICS XI 4-MCL，CD4-FITC、溶血剂等购自美国Becton Dicknson 公司，PE 标志的PD-L1、PD-1 及同型对照管购自美国eBioscience 公司;RT-PCR 试剂盒购自Fermentas 公司。

1.5 外周血PD-1/PD-L1 表达水平检测 取3 支专用流式管，分别加入抗人CD4-FITC 抗体10μl 和MouseIgG1-PE 同型质控2.5μl、抗人CD4-FITC 抗体10μl和抗PD-1-PE 抗体2.5μl、抗人CD4-FITC 抗体10μl和抗人B7-H1-PE 抗体2.5μl，然后每管各加入全血50μl，混匀，避光15min 后加入1ml 溶血剂，室温放置10min，1 500r 离心，5min 弃上清，再分别加入lml 生理盐水，混匀，1 500r 离心，5min 弃上清，最后加入500μl～1ml 生理盐水重悬细胞，上流式细胞仪检测。采用FS-SS 参数分析基础上，对全PBMC 设门，设定CD4 阳性细胞门，检测CD4+T 细胞上PD-1/PD-L1 的表达水平，并扣除同型对照的非特异性本底值。

1.6 统计学方法 用SPSS 13.0 统计软件建立数据库并进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间均数比较用两独立样本的t 检验;计数资料用(%)表示，组间采用卡方检验;P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者ALT 复常率和HBV DNA 转阴率比较见表2。

2.2 两组患者CD4+T 细胞PD-1 表达水平比较 见表3。

表2 两组患者ALT 复常率和HBV DNA 转阴率比较［% (n)］

表3 两组患者CD4 +T 细胞PD-1 表达水平比较(±s)

表3 两组患者CD4 +T 细胞PD-1 表达水平比较(±s)

与本组24 周比较，* P ＜0.05;与本组治疗前比较，#P ＜0.01

2.3 两组患者CD4+T 细胞PD-L1 表达水平比较 见表4。

表4 两组患者CD4 +T 细胞PD-L1 表达水平比较(±s)

表4 两组患者CD4 +T 细胞PD-L1 表达水平比较(±s)

与本组24 周比较，* P ＜0.05;与本组治疗前比较，#P ＜0.01

3 讨论

CD4+T 细胞(Th)主要分为Th1 和Th2 两种亚型，其中Th1 分泌IFNγ、IL-2 等参与细胞介导的免疫应答，可以充分强化特异性CTL 反应，倾向于发生急性自限性感染和病原体清除。既往研究发现HBV 持续感染与Th1/Th2 失衡有关［3］，在CHB 患者体内Th2 类细胞因子IL-6、IL-10 占优势，而Th1 类细胞因子IFN-γ、IL-2 明显减少，HBV 清除不足，导致HBV 感染慢性化。彭国平等［4］研究表明CHB 患者PD-1 和PD-L1 表达水平是显著增加的，另有学者证实Th1 细胞能诱导PD-L1 表达增强，而PD-1/PD-L1能抑制Th1 细胞的增殖，减少IFN-γ 和IL-2 等Th1类细胞因子的分泌，影响Th1/Th2 细胞的分化［5，6］。本项研究通过芪灵合剂联合LAM 治疗发现，CHB 患者外周血CD4+T 细胞表面PD-1/PD-L1 表达水平24周后有所下调，但与治疗前相比无明显差异，随着治疗时间延长其表达水平明显下调，48 周的统计分析结果较24 周及治疗前相比具有统计学意义，同时发现，治疗组较对照组更有效地下调CHB 患者外周血CD4+T 细胞表面PD-1/PD-L1 表达水平(P ＜0.05)，虽然有报道，CHB 抗病毒治疗早期能够下调PD-1/PD-L1 表达水平［7］，但在本实验中的对照组并未表现出明显下调外周血CD4+T 细胞表面PD-1/PD-L1 表达水平的能力(P ＞0.05)。

CHB 患者血清基线高载量HBV DNA 是发生肝癌的独立危险因素［8，9］，抗病毒治疗可以延缓HBV 感染后肝硬化的进展及降低肝癌的发生率［10，11］，故清除或抑制病毒复制是预防肝脏严重不良预后发生的重要环节。我们的研究注意到，对照组患者治疗48 周后虽有较高的HBV DNA 转阴率(66.67%)，但其外周血CD4+T 细胞PD-1/PD-L1 表达水平并未有明显下调(P ＞0.05)。而治疗组患者的外周血CD4+T 细胞PD-1/PD-L1 表达水平除有明显下调外，HBV DNA转阴率也更高(89.66%)，与对照组相比有统计学意义(P ＜0.05)，另外ALT 复常率治疗组也占明显优势(72.47%VS 66.67%)。核苷(酸)类抗HBV药物治疗后，HBV 特异性CD8+T 淋巴细胞功能虽能逐渐恢复，但即使出现HBsAg/抗-HBs 转换的患者其T 淋巴细胞功能恢复仍显缓慢，有的甚至不能完全恢复。尽管对CHB 发病机制的研究已经有了长足进展，但其发病机制尤其是免疫机制及相关免疫治疗的进展难以有较大突破，病毒动力学及免疫学相结合的研究迫在眉睫。中医认为CHB 发病是因人体正气虚衰，不足以抗御外邪，导致疫毒侵袭，正所谓“邪之所凑，其气必虚”。有研究者认为治疗CHB 扶正之法在于调补脾肾，以平衡肾之元阴、元阳为要。此时临证可以黄芪、仙灵脾为调补脾肾之基础用药。仙灵脾温肾阳，黄芪补后天以滋先天［12］。多年临床应用芪灵合剂后发现其能促进慢性HBV 感染患者病毒应答，提高HBV DNA 清除率，所复习的文献提示，黄芪可明显提高CHB 患者Th1 类细胞因子(IFNγ、IL-2)的产生，改善CHB 患者Th1/Th2 功能失衡状态，可使CHB 患者Th2 细胞优势应答状态部分得到纠正，并具有一定的抗病毒作用［13，14］。仙灵脾又称淫羊藿［15］，研究发现［16，17］其有效成分淫羊藿多糖(EPS)具有促进小鼠T 细胞和B 细胞增殖的作用;EPS 通过促进胸腺成熟细胞向外周释放而对胸腺产生免疫激活作用，能使小鼠胸腺和脾脏细胞合成IL-2 增多。结合研究结果，芪灵合剂能够降低外周血CD4+T 细胞表面PD-1/PD-L1 表达水平，使Th1 细胞功能恢复，并促进其分化、增殖，IFNγ、IL-2 分泌增多，纠正CHB 患者Th1/Th2 功能失衡状态。

在急性乙型肝炎早期，HBV 抗原特异性T 细胞PD-1 表达上调，并随着病情的恢复而下调，但若PD-1/PD-L1 延迟表达或低水平表达，则易发展为急性肝衰竭，预后不良［18］。这提示，CHB 患者外周血PD-1/PD-L1 的表达早期如果大幅度降低具有一定的风险。芪灵合剂对CHB 患者的免疫调节具有持续、和缓甚至后续累积的效应，规避了PD-1/PD-L1 过早、过度下调所带来的免疫损伤风险。本研究如能进一步延长干预时间，加强跟踪随访，观察PD-1/PDL1 表达水平是否有进一步下调的空间和维持较长时间的临床效果，同时分析芪灵合剂对HBV 特异性CD8+T 细胞及IFNγ、IL-2 分泌水平的影响以及机理，则此项研究将更有意义。

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