原发性肝癌患者血管紧张素转化酶与血管紧张素转化酶2 基因转录水平变化趋势*

齐明华 刘吉奎 叶 静 漆正宇 万汇涓 李明华 余光银 尹耀新 欧 希

1.北京大学深圳医院感染性疾病科(广东 深圳，518036) 2.深圳医院肝胆外科 3.深圳医院中心实验室 4.深圳医院病理科

原发性肝癌是一种发病率和死亡率都很高的疾病，全世界每年平均约有25 万人死于肝癌，高居肿瘤死亡人数第5位;原发性肝癌也是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在我国消化系统恶性肿瘤中居第3 位，占世界肝癌死亡病例的45%［1］。

研究发现，组织通过自分泌和旁分泌产生的局部肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)与癌症的发生和转移密切相关。RAS 的ACE-Ang 2-AT1 受体轴和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受体轴中，Ang2 为血管紧张素2 (angiotensin 2)，而AngⅠ-7 为血管紧张素1 的降解产物7 肽(angiotensin1-7)。这两个受体轴都能影响肿瘤增生和转移，但作用相反。ACE-Ang 2-AT1 受体轴起促进肿瘤增生和转移的作用，例如，AT1 受体表达与胃癌淋巴结转移及肿瘤侵袭正相关［2］，而且ACE 抑制剂可以显著减少小细胞肺癌淋巴结转移［3］。ACE2-AngⅠ-7-Mas 受体轴则对肿瘤增生和转移起抑制作用，研究表明，ACE2 在小细胞肺癌和胰腺癌癌巢组织表达下调，使ACE2 基因静默，可以促进肿瘤细胞增生［4］。用AngⅠ-7 处理肺癌接种模型的体内试验表明，AngⅠ-7 可以减少肺癌肿瘤细胞增生［5］。

我们通过比较肝癌患者癌组织与癌旁组织ACE、ACE2 及其受体AT1、MAS 基因转录水平的差异，初步揭示ACEAng2-AT1 受体轴和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受体轴在原发性肝细胞癌中相互制约从而达到平衡的现象。

1 材料与方法

1.1 一般材料 实验中6 例份肝癌和癌旁标本均为我院2010年和2011年手术切除标本，病理学资料齐全。患者均未接受放化疗，临床资料见表1。

表1 患者的临床及病理资料

1.2 试剂 Trizol 试剂购自Invitrogen 公司。RT-PCR 试剂盒及SYBRGreen qPCR 试剂盒均购自Fermantas 公司。ACE、ACE2、AT1 及MAS 引物由上海生工公司合成，见表2。

表2 试验中用到的引物序列

1.3 方法 分别称取-80℃冰箱保存的12 例配对组织标本各100mg。Trizol 法提取组织总RNA，经酚氯仿抽提纯化。用紫外分光光度仪测定A260/A280 值均在1.9～2.0 之间，RNA纯度较好。使用Fermantas 公司逆转录试剂盒，oligo (dT)为引物，按标准流程合成cDNA。

RT-qPCR 的ΔΔCT 法相对定量ACE、ACE2 及其受体AT1、MAS 基因的转录水平。采用Fermantas 荧光定量试剂盒，按标准流程，二步法在ABI Prism 7000 荧光定量PCR 仪上进行qPCR 反应，95℃初步变性10min，95℃变性15s，60℃延伸30s，共30 个循环反应。反应内参为18s RNA。每批实验均设立阴性对照及阳性对照。

1.4 判定标准 ΔCT 癌巢/ΔCT 癌旁 ＞1 表明癌巢表达较癌旁高，＜1 表明癌巢表达较癌旁低。

2 结果

实验显示，相对于癌旁组织，癌巢组织中ACE 与ACE2的基因转录水平变化趋势一致，协同升高或降低;ACE 和AT1 的基因转录水平变化一致，协同升高或降低。但ACE2 与其受体MAS 的基因转录水平一致性不好，只有E 和F1 两例病人的癌巢组织/癌旁组织趋势一致，分别为协同降低，其他病例表达不一致。见图1 及图2。

图1 癌巢组织/癌旁组织ACE 与ACE2的基因转录水平变化趋势一致

图2 癌巢组织/癌旁组织ACE 与AT1的基因转录水平变化趋势一致

3 讨论

以往，人们认为肾素-血管紧张素(RAS)主要作用是调控血压，调节水盐平衡。近年来，不论是临床研究，还是动物试验，以及体外研究均发现，RAS 在恶性肿瘤中表达失衡，而且与预后密切相关。RAS 的拮抗剂可以抑制肿瘤生长、转移和血管形成，回顾性临床研究则发现，长期口服ACE 抑制剂可以预防肿瘤。而且这种作用与RAS 的降压作用无关［7～11］。

随后的深入研究主要在对AT1 受体的表达与癌症的关系方面，研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌及胃肠道肿瘤中，AT1 的表达均异常，且这种异常源于这些组织原本在正常生理活动中起作用的局部的RAS 组分［11］。

但是，目前原发性肝细胞癌中RAS 组分表达情况的研究尚未见到。本文首次从临床标本入手，通过自身对照，研究原发性肝细胞癌癌组织和癌旁组织RAS 主要组分的表达情况，为探讨RAS 与原发性肝细胞癌发生、生长的关系提供了实验依据。自体癌组织和癌旁组织对照，较好地平衡了个体间差异。

RAS 复杂的组分中，ACE-Ang 2-AT1 受体轴与ACE2-AngⅠ-7-MAS 受体轴是两个主要的调控系统，在恶性肿瘤发生、生长和转移中起到调控作用。本文首次探讨了ACE-Ang2-AT1受体轴与ACE2-AngⅠ-7-MAS 受体轴在原发性肝细胞癌中的相互作用规律。实验结果表明，相对于癌旁组织，癌巢组织中ACE 与ACE2 的基因转录水平变化趋势一致，协同升高或降低;ACE/AT1 的基因转录水平变化一致，协同升高或降低，提示原发性肝细胞癌患者中，ACE-Ang 2-AT1 受体轴与ACE2-AngⅠ-7-MAS 受体轴的调控作用是彼此制约，当ACE表达增强时，ACE2 代偿性升高，从而达到平衡;而ACE 表达增强的同时，AT1 表达也增强，反之降低，说明ACE 可能是通过AT1 起到调控作用的。

在具体的RAS 组分与肿瘤的关系中，研究最多的是AT1受体同肿瘤发生、增殖、转移的关系，这方面乳腺癌的研究较深入。有研究显示，有约占10%～20%的乳腺癌中，AT1表达明显增高［12，13］，而且，AT1 表达与肿瘤进展过程中不同阶段有关，比如在增生及原位癌阶段，AT1 在乳腺癌中的表达较高，而在侵袭性阶段则降低［14］。

我们首次关注AT1 在原发性肝细胞癌中的基因表达情况，在癌巢中呈高表达的有3 个病例:病例A，D，F;在癌巢中呈低表达的有3 个病例:病例B，C，E，各占50%。高转录水平的3 个病例中有1 例出现血管侵犯，2 例无血管侵犯;低表达的3 个病例中，也是有1 例出现血管侵犯，2 例无血管侵犯，差异不明显。但观察高转录水平病例中，有2 例肿瘤较小，1 例肿瘤较大;低表达病例则是3 例肿瘤较大，似乎AT1转录水平与肿瘤生长有关，AT1 转录水平低，肿瘤体积大。4例肿瘤大小评分为2 的病例，即B，C，D，E 中，肝内肿瘤的个数在B，E 中为3，AT1 低转录水平为100%;C，D 病例中肝内转移瘤个数为2，AT1 低转录水平为50%。提示相同原发癌灶大小的情况下，AT1 转录低水平可能更有利于肝内转移，与乳腺癌研究中AT1 在增生及原位癌阶段的表达较高，而在侵袭性阶段则降低的研究结论一致［14］。ACE2 和MAS 的基因转录水平不一致，这可能是因为MAS 基因转录水平受影响转多，而且目前MAS 的蛋白结构还没有完全得到确认，严格意义上，它作为受体的作用还没有完全确认，人们对于它的了解相当有限。

本研究虽然病例较少，但因为RAS 系统与原发性肝细胞癌的关系是首次探索，因此具有较好的创新性，今后的研究可以扩大样本量，并延伸到蛋白水平，进一步确证ACEAng2-AT1 受体轴与ACE2-AngⅠ-7-MAS 受体轴在原发性肝细胞癌中的变化规律，及AT1 受体在原发性肝细胞癌肿瘤生长，肝内转移方面的作用。

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