虫草菌丝对IL-1β诱导MIN6细胞凋亡的保护作用与机制的实验研究

郑 倩,刘 华,曹弟勇,杨尚君,赵小蓉,米贵飞,赵雅茜,肖昊卓

(川北医学院 1.机能实验中心；2.药理学教研室；3.寄生虫学教研室；4.2012级临床医学系，四川 南充 637100)

研究证实IL-1β是重要的内源性细胞因子，其可通过影响NO[1]、Ca2+[2]、线粒体膜电位、ROS[3]以及内质网应激[4]多种途径导致细胞凋亡，最终导致糖尿病。虫草菌丝(cordyceps sinensis,CS)是人工发酵培养得到的菌丝，近年来其对糖尿病的防治作用受到了广泛关注，我们前期工作采用IL-1β损伤离体乳鼠胰岛细胞并用CS进行干预，发现CS可以增加乳鼠胰岛细胞活性和分泌功能，其保护机制与降低细胞内Ca2+浓度，降低NO、ROS的生成以及提高SOD、GSH-PX的活性有关[5-6]。目前国内外的研究证实解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP-2)可以通过影响ATP的生成、调节胰岛素的分泌，抑制细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成，诱发胰岛细胞的凋亡参与糖尿病的发生发展过程，成为了研究的热点。本研究探讨CS对IL-1β诱导的MIN6细胞凋亡的作用以及机制是否与ROS水平和UCP-2表达有关。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

MIN6细胞购自上海拜力公司，CS(上海雅吉，A-0159)，IL-1β(invitrogen,792008D)，高糖DEEM，胎牛血清(hyclone,nzk0677)，Hochest33342，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Beyotime,C1056)，活性氧检测试剂盒(南京建成,A087)。荧光显微镜(Leica,德国)，荧光分光光度计(BIO-RAD,美国)，酶标仪(BIO-RAD,美国)，流式细胞仪(Acuuri，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 选用第28～35代MIN6细胞为研究对象,MIN6细胞在含150 mL/L FBS、青、链霉素各10 U/mL的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。每2～3 d换液1次，5～6 d传代1次，80%汇合时进行实验。以每孔5×105mL/L细胞接种于细胞培养板，培养24 h后，进行实验分组。随机分组：(1)正常对照组；(2)IL-1β(20 nmol/L)组；(3)IL-1β+低剂量CS1组；(4)IL-1β+高剂量CS2组，每组平行孔为6孔。正常对照组以含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，(2)～(4)组每孔细胞中各加入20 nmol/L的IL-1β作用24 h后，再分别加入不同浓度的CS(CS1：1 mmol·L-1，CS2：5 mmol·L-1)继续培养24 h，进行各项检测。

1.2.2 CCK8检测细胞活性 将处理完毕的各组细胞用CCK8法进行检测。方法如下：将96孔细胞培养板离心(500 r/min×5 min)，然后吸取细胞培养上清液，于细胞中加200 μL的培养液(不含小牛血清)和20 μL的CCK8，放入CO2孵育箱培养1 h后，在全自动酶标仪上比色，测出每孔光密度值(OD值)进行比较，检测波长为450 nm，OD值越高表明细胞活性就越强。

1.2.3 胰岛素分泌量测定 各组待测标本细胞培养上清液，用Elisa试剂盒检测胰岛素的基础分泌量；各组细胞中加入含16.7 mmol·L-1的葡萄糖培养液培养2 h，离心提取上清液，按Elisa进行高糖刺激胰岛素分泌量检测。

1.2.4 Hochest33258染色检测细胞凋亡 将10 μL Hochest33258加入培养的细胞中,终浓度为10 μg/mL,37 ℃孵育15 min，收集细胞，制成细胞爬片，荧光显微镜下观察细胞核，了解细胞凋亡情况。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 每个样品收集约5×105mL/L细胞于1.5 mL离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用1 mL细胞染色缓冲液重悬，加入5 μL Annexin V-FIT和5 μL PI染色液，混匀，室温避光孵育20 min，在1 h内流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。Annexin V-FITC+PI-象限为凋亡早期细胞；Annexin V-FITC-PI+为坏死细胞；Annexin V-FITC+PI+为凋亡晚期坏死细胞；Annexin V-FITC-PI-为活细胞。

1.2.6 Western blot检测UCP-2蛋白含量 收集培养细胞，离心去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗2～3遍，用手指把细胞用力弹散，按每管细胞加入200 μL的比例加入裂解液，同时加入PMSF。用手指轻弹管底以促使裂解液和细胞充分接触，用考马斯亮蓝法测定各细胞样本蛋白含量。SDS-PAGE电泳半干转法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，恒压电泳，将电压调至80 V使样品通过浓缩胶与分离胶(电压约8 V/cm)。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。室温封闭1 h，将一抗用封闭液稀释(UCP-2抗体稀释度均为1∶300，内参抗体稀释度为1∶1 000)；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4 ℃反应过夜；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液(1∶3 000)中，室温、避光缓慢摇动作用60 min；用1×TBST洗膜，曝光及洗片。用image J软件分析灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 胰岛细胞活性的变化

与正常组对照组相比，IL-1β组光密度值OD值明显降低，表明胰岛细胞活性显著下降(P<0.01)；加入低浓度和高浓度CS共同孵育可使OD值较损伤组均有不同程度的提高，具有显著意义(P<0.05，P<0.01)，且有剂量依赖性(表1)。

表1 各组细胞光密度，基础胰岛素和高糖刺激胰岛素分泌水平

*P<0.01，与对照组比较；#P<0.05，△P<0.01，与IL-1β组比较。

2.2 基础和高糖刺激胰岛素分泌量的测定

实验结果见表1，IL-1β作用后胰岛细胞胰岛素基础分泌量和葡萄糖刺激分泌量均显著下降(P<0.01)，在IL-1β作用的基础上与不同浓度CS共同培养24 h后，细胞的分泌功能显著增强，表现为基础和高糖刺激的胰岛素分泌增多，有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。

2.3 CS对MIN6细胞活性氧的含量的影响

IL-1β与胰岛细胞作用后ROS活性增加，与正常组相比差异显著(P<0.01)。与IL-1β组相比，经CS共同孵育后，ROS的活性明显降低，而且有剂量依赖性，高剂量组ROS的活性低于低剂量组，有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，实验结果见表2。

2.4 CS对MIN6细胞凋亡的影响

正常组细胞呈均一蓝色，且颜色偏浅。凋亡细胞细胞核呈致密浓染，亮度高，有的可见裂解的凋亡小体，IL-1β组凋亡细胞明显增多，与CS作用后凋亡细胞减少(图1)。采用流式细胞技术进行定量分析，检测结果显示对照组胰岛细胞凋亡率为5.03±0.78；加入IL-1β作用后胰岛细胞凋亡率显著增加为24.5±0.65(P<0.01)；不同浓度CS作用均降低细胞凋亡率，高浓度CS作用后明显降低凋亡率至9.08±0.36(P<0.01)，具有统计学意义(表2，图2)。

表2 细胞凋亡率、ROS和UCP-2蛋白的表达

*P<0.01，#P<0.001，与对照组比较；△P<0.05，▲P<0.01，□P<0.001，与IL-1β组比较。

2.5 CS对IL-1β作用的MIN6细胞UCP-2蛋白相对含量的影响

由图3，表2可知，加入IL-1β作用后胰岛细胞UCP-2蛋白相对含量表达明显下调，与正常组相比有统计学意义(P<0.001)；与不同浓度CS共同孵育后，UCP-2蛋白含量上调，高于IL-1β组，有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

MIN6细胞系是胰岛素启动子控制下表达SV40大T抗原的小鼠胰岛肿瘤的细胞系，葡萄糖刺激的胰岛素分泌强度与正常的胰岛β相似，因此常被用来研究胰岛β细胞的功能。本研究结果表明，IL-1β在体外环境能诱导MIN6细胞凋亡，通过荧光染色和流式细胞技术可以证实凋亡的存在。多项研究[7-9]表明，氧化应激是导致胰岛β细胞功能衰退的重要因素，ROS可直接损伤β细胞，特别是破坏细胞线粒体结构，促进β细胞凋亡。UCP-2是线粒体内膜上解偶联蛋白家族成员之一，其广泛存在脾脏、下丘脑、胰腺、心脏和肺等多种组织中，能通过质子漏作用，使线粒体内膜外的质子直接进入线粒体基质，降低了内膜两侧的质子电化学梯度，使氧化过程与二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)磷酸化过程解偶联，从而使ATP合成减少，能量以热能的形式释放，同时由于内膜两侧质子电化学梯度降低，呼吸链上的电子回漏减少，使ROS生成减少。UCP-2可以通过降低ROS的生成降低凋亡的生成从而保护细胞功能。

有研究发现小鼠胰岛和INS-1E细胞系中有UCP-2的表达[10-11]，本实验结果提示MIN6细胞亦有UCP-2的表达。IL-1β作用MIN6细胞后ROS明显增加，同时UCP-2的表达降低，证实IL-1β引起MIN6细胞凋亡途径与UCP-2蛋白表达降低，ROS水平增加有关。多篇文献报道IL-1β可以下调UCP-2的表达[12-13]，与本研究类似，也有研究得到不同的结果，Luo[14]观察到IL-1β可以上调INS-1细胞中UCP-2的表达，可能与采用的细胞以及使用的剂量有关，值得进一步深入研究。

细胞凋亡在糖尿病的发生和发展中起着非常重要的作用，阻断胰岛细胞凋亡可降低糖尿病的发生，因此抑制凋亡的药物筛选成为研究的热点。

虫草菌丝是本课题组筛选的对胰岛细胞具有保护作用的药物，前期的研究证实虫草菌丝对IL-1β损伤的胰岛细胞有保护作用，其保护机制与降低NO和Ca2+浓度以及提高CO/HO系统活性有关，但是其对MIN6细胞凋亡的保护机制研究并未涉及。本实验证实，CS可以降低IL-1β诱导的MIN6胰岛细胞凋亡，凋亡率显著降低，同时细胞活性增强，胰岛素的分泌功能增加，说明其对IL-1β诱导的MIN6细胞凋亡有保护作用。并且通过Western Blot检测发现细胞UCP-2蛋白的表达增加，ROS水平降低，说明其降低凋亡保护细胞功能的机制可能与增加UCP-2的表达，降低ROS的生成有关，有效地清除自由基，改善氧化应激反应，减少胰岛细胞的氧化损伤。本研究为寻找2型糖尿病的中药治疗打下了理论基础，同时为2型糖尿病的治疗提供新的思路与临床用药筛选，不过CS对2型糖尿病的保护作用机制仍然需要进一步研究。

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