39例足癣复发后病原菌核糖体基因序列变化

杜迎春郑家地

39例足癣复发后病原菌核糖体基因序列变化

杜迎春1郑家地2

目的: 检测红色毛癣菌足癣复发后致病菌株基因型的变化。方法: 对39例红色毛癣菌足癣复发后进行红色毛癣菌核糖体保守区(部分5.8s和ITS－2)和非转录间隔区(NTS)内的两个重复亚单位(TRS－1,TRS－2)进行PCR扩增,基因序列测定。结果: 39株红色毛癣菌复发前后和标准株保守区基因序列测定比较,同源性均达99%,均为红色毛癣菌；(NTS)内的两个重复亚单位(TRS－1,TRS－2)基因序列测定比较,其中3株菌TRS－1区存在个别碱基突变,3株TRS－1区存在重复序列拷贝数变异,1株菌TRS－2区存在个别碱基突变。结论: 复发后的红色毛癣菌基因型基本稳定,说明足癣复发大部分与原浅表真菌复燃有关。

足癣； 红色毛癣菌； 核糖体非保守区； 基因序列测序

足癣是一类最常见的真菌感染性疾病,具有传染性、发病率高、易复发和再感染的特点,虽不危及生命,但对患者的生活质量有不同程度的影响。本研究将39例红色毛癣菌所致足癣复发前后的核糖体非转录间隔区NTS内的两个重复亚单位(TRS1,TRS2)及保守区(部分5.85和ITSZ)进行PCR扩增,序列测定,比较其变化,从而探讨复发足癣感染是原红色毛癣菌复燃,还是新的浅表真菌感染。

1 材料和方法

1.1 一般资料 39例足癣患者均来自2012年7～9月厦门市中医院皮肤科,取皮损处皮屑镜检及培养后经菌落形态、镜下形态均鉴定为红色毛癣菌,并进行贮藏、保存。同时跟踪随访患者,次年再次复发者再取其皮屑进行培养鉴定。

1.2 菌株的培养与保存 (1)培养与保存:将两次取得的菌株分别进行培养,采用SDA试管培养基,放入电热恒温培养箱(27℃),共2周。(2)保存:恒温培养箱内培养2周后,置于室温下保存,每3个月向试管内加少许无菌蒸馏水,用胶带将试管口密封。

1.3 DNA的提取及纯化 取培养的菌体放入无菌研钵中,用足量的液氮将其研至粉末状,进行提取与纯化。用煮沸冻融法结合经典酚氯仿法1,2制备高样本。

1.4 PCR扩增及产物鉴定

1.4.1 扩增部分5.8S和ITS－2区PCR反应体系TaKaRa ExTaq 0.25μL(5 U/μL),10×ExTaq Buffer 5 μL,dNTP混合液4μL(2.5mmol/L),引物各2μL(10 pmol),模板(基因组DNA)1μL,灭菌ddH2O补足50 μL。PCR反应条件:95℃预变性5 min后30个循环: 94℃30 s,60℃30 s,72℃1 min；继之72℃延伸7 min。取5μL产物0.9%琼脂糖电泳。

1.4.2 扩增TRS－1,TRS－2区PCR反应体系 TaKa-Ra ExTaq 0.25μL(5 U/μL),10×ExTaq Buffer 5μL,dNTP混合液4μL(2.5 mmol/L),引物各2μL(10 pmol)模板DNA 1μL,灭菌12 ddH2O补足50μL。PCR反应条件:TRS－1区:94℃预变性2 min后30个循环:94℃30 s,58℃30 s,72℃1min；继之72℃延伸7 min。TRS－2区:94℃预变性1 min后30个循环: 94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min；继之72℃延伸7 min。各取5μL产物1%琼脂糖电泳。

1.5 PCR产物的纯化 采用北京鼎国生物技术发展中心的DNA快速纯化/回收试剂盒进行PCR产物纯化。

1.6 测序 纯化产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果用BLAST软件比较分析。

2 结果

2.1 菌株核糖体保守区(部分5.8s和ITS－2)基因序列测定结果 39株红色毛癣菌及次年复发菌株片段大小均约为320 bp,与基因库红色毛癣菌标准株ATCC28188基因序列同源性比较,用Blast软件分析,同源性均达99%,证明复发后的菌仍为红色毛癣菌。

2.2 NTS区TRS－1和TRS－2 PCR指纹图谱扩增结果

2.2.1 TRS－1区PCR指纹图谱扩增结果 39例复发足癣患者中有36例红色毛癣菌菌株NTS区中TRS－1区与原菌株PCR产物的指纹图一致,可分为4型,其中18株为1型(菌株23’为代表)；8株为2型(菌株14’为代表)；5株为3型(菌株11’为代表)；5株为4型(菌株34’为代表)。见图1～3。

图1 2～13泳道为红色毛癣菌TRS－1区PCR产物电泳图。1、14泳道为Marker DL2000

2.2.2 TRS－2区PCR指纹图谱扩增结果 39例复发足癣患者红色毛癣菌菌株与原菌株NTS区中TRS－2区PCR产物的指纹图一致,而且每株菌的分子量大小也大致相同,列举任意12株菌(图4)。

2.3 菌株核糖体非转录区(NTS)内TRS－1区和TRS－2区基因序列测定结果 TRS－1区以200 bp为一个拷贝单位串联重复排列,紧接一个23～33 bp的部分重复,并且每个拷贝单位的基因序列基本一致；TRS－2区是以77 bp为一个拷贝单位串联重复排列,紧接一个27 bp的部分重复,每个拷贝单位的序列也基本一致。

图2 2～13泳道为12株红色毛癣菌NTS区中TRS－1区PCR产物电泳图。1、14泳道为Marker DL2000

图3 2～13泳道为12株红色毛癣菌NTS区中TRS－1区PCR产物电泳图。1、14泳道为Marker DL2000

图4 2～13泳道为任意12株红色毛癣菌NTS区中TRS－2区PCR产物电泳图。1、14泳道为Marker DL2000

2.3.1 每株菌TRS－1区重复单位基因序列基本相同,但38’菌和10’菌TRS－1区第一个重复单位的第198～200位碱基检测到突变(TCG→CAT)(图5、6), 28’菌TRS－1区第二个重复单位中第194位碱基检测到突变(G→C)(图7)。每株菌复发后TRS－2区重复单位基因序列大部分相同,其中17’菌的第二个重复单位第74位碱基检测到突变(G→A)(图8)。

2.3.2 TRS－1区和TRS－2区拷贝数变异 4’原菌株TRS－1区约为400 bp,此区内包含1个拷贝单位,紧跟一个27 bp的部分重复,TRS－2区约为360 bp,此区内包含2个拷贝单位,紧接一个27 bp的部分重复。复发后菌株TRS－1区约为835 bp,此区内包含3个拷贝单位,紧接一个25 bp的部分重复,TRS－2区约为480 bp,此区内包含2个拷贝单位,紧接一个27 bp的部分重复。

图5 38’菌TRS－1区第一个重复单位部分测序图(箭头示第198～200位碱基TCG→CAT)图6 10’菌TRS－1区第一个重复单位部分测序图(箭头示第198～200位碱基TCG→CAT,因该反应为第二个反应,测序时反向互补,图中ATG的反向互补序列即为CAT)图7 28’菌TRS－1区第二个重复单位部分测序图(箭头示第194位碱基G→A)图8 17’菌TRS－2区第二个重复单位部分测序图(箭头示第74位碱基G→A)

55’原菌株TRS－1区约为957 bp,此区内包含3个拷贝单位,紧跟一个23 bp的部分重复,TRS－2区约为360 bp,此区内包含2个拷贝单位,紧跟一个27 bp的部分重复。复发后菌株TRS－1区约为1310 bp,此区内包含4个拷贝单位,第2个重复单位后面紧跟一个33 bp的部分重复,TRS－2区约为500 bp,此区内包含2个拷贝单位,紧接一个27 bp的部分重复。

30’原菌株TRS－1区约为950 bp,此区内包含3个拷贝单位,紧跟一个23 bp的部分重复,TRS－2区约为480 bp,包含2个拷贝单位,紧接一个27 bp的部分重复,并将其复发后菌株与其原菌株比较发现, TRS－1区约为410 bp,此区内包含1个拷贝单位,紧跟一个27 bp的部分重复,TRS－2区约为380 bp,此区内包含2个拷贝单位,紧跟一个27 bp的部分重复。

3 讨论

足癣是皮肤科常见的感染性疾病内服和外用抗真菌药可获得暂时痊愈,但容易复发,因此确定患者的复发是原有真菌复燃还是新的真菌再感染,对流行病学研究和完善临床治疗方案至关重要。临床约72%的足癣由红色毛癣菌感染所致,由于红色毛癣菌严格的无性生殖特点,其基因结构是相当保守的,种内变异的程度也是有限的。红色毛癣菌的核糖体DNA(rDNA)重复区存在多态现象,rDNA非转录间隔区(NTS)内有两个串联排列的亚重复元件(TRSs),即TRS－1区和TRS－2区。3通过对TRS1区重复单元的序列分析证实NTS区域长度变异主要是由于TRS－1区拷贝数的变异。4这种重复DNA片断的多态性是局部的,与基因组存在的重组和突变所致的多样性无关,针对整个基因组多样性的PCR不能发现这种小卫星或微卫星多态性,近年来常针对rDNA的ITS区域进行种间分类。5红色毛癣菌rDNA的非转录间隔区(NTS)内串联重复亚单位TRS－1和TRS－2 (TRSs),在不同的菌株拷贝数不同,为株间变异区所在,故TRSs区指纹图谱能显示株间差异。6本研究将39例足癣的红色毛癣菌及其复发后的红色毛癣菌核糖体非保守区NTS内的两个重复亚单位(TRS－1, TRS－2)进行PCR扩增,非转录间隔区(NTS)内TRS－1、TRS－2区的基因序列基本稳定,但38’菌和10’菌在TRS－1区第一个重复单位有三个碱基发生置换, 28’菌在TRS－1区第二个重复单位有一个碱基发生置换说明核糖体非保守区(NTS)中TRS－1区的序列还是相当稳定的,说明姐妹染色体不等位交换并非经常发生,从而证实了红色毛癣菌在一年中的保存过程中,菌种的NTS区中重复单位的数目和长度稳定,但重复单位中个别碱基有可能发生重组或改变。3

足癣复发的原因诸多,随着抗真菌药物在临床应用日益广泛,真菌耐药已成为日益严重的问题。536例足癣患者复发的原因可能为治疗不彻底,导致皮肤上有残存菌,次年夏季气温升高,残存菌迅速繁殖,再次出现临床症状。3例患者基因保守序列鉴定为红色毛癣菌,但TRS－1区基因序列与原菌株不同,可能因彻底治疗后,在某些易感因素下再次感染了不同型别的红色毛癣菌,但仅占总例数的8.33%。因本研究样本数尚少,暂未发现有其它种属的浅部真菌感染。

1CURTIS JW.The two foot－one hand disease.Bull Assoc milit Dermatol,1964,13:1.

2李筱芳,陈辉,崔凡,等.浅部真菌病临床标本致病菌提取方法的初步研究.医学研究杂志,2006,3:18－20.

3 Jackson CJ,Barton RC,Evans EG.Species identification and strain differentiation of dematophyte fungi by analysis of ribosomal DNA intergenic spacer regions.JClin Microbiol,1999,37 (4):931－936.

4 Jackson CJ,Barton RC,Kelly SL,et al.Strain identification of Trichophyton rubum by specific amplification of subrepeat elements in the ribosomal DNA nontranscribed spacer.JClin Microbiol,2000,38(12):4527－4534.

5 Loeffler J,Stevens DA.Antifungal drug resistance.Clin Infect Dis,2003,36(Supp l 1):3－41.

6 Jousson O,Léchenne B,Bontems O,et al.Secreted subtilisin gene fam ily inTrichophyton rubrum.Gene,2004,339:79－88.

(收稿:2013－07－18 修回:2013－12－09)

The changes of DNA sequence of pathogen after relapse in athlete's foot

DU Ying-chun,ZHENG Jia-di.Department ofDermatology,Xiamen Hospital of T.C.M,361000

Objective:To determine the changes of DNA sequence of Trichophytin rubrum after relapse in athlete's foot.Methods:Two epetition subunits(TRS－1,TRS－2)of Trichophyton rubrum ribosomal non－conservertive region NTSwere amplified by PCR and followed by gene sequencing in 39 patients with relapsed athlete's foot.Results:The Trichophyton rubrum ribosomal non－conservative region NTS in the first and the second isolates of tinea pedis was very close(the isogeny was 99%).Individual base mutation happened in TRS－1 region of 3 cases or TRS－2 region of1 case.Copy number of gene duplication sequence in TRS－1 region of ribosomal non－conservative region was seen in 3 cases.Conclusion:The genotype of Trichophyton rubrum is stable in the isolates of the patients with relapsed tinea pedis.Recurrence of tinea pedis wasmost likely caused by the existing fungi rather than new infectionswith other stains of fungi.

tinea pedis；Trichophyton rubrum；ribosomal non－conservative region；gene sequencing

福建中医药大学校管科研课题(编号:XB2012039)

1厦门市中医院皮肤科,福建厦门,361000

2厦门市中医院神经外科,福建厦门,361000