寻常型银屑病皮损中血管紧张素II及血管紧张素转化酶的检测

蔡艳霞蔡川川樊翌明张锡宝

·短篇论著·

寻常型银屑病皮损中血管紧张素II及血管紧张素转化酶的检测

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目的: 检测寻常型银屑病皮损中血管紧张素II(AngII)及血管紧张素转化酶(ACE)的水平变化。方法: 应用荧光定量聚合酶链反应(FQ－PCR)和免疫组化技术检测30例寻常型银屑病患者(进行期17例,静止期13例)皮损Ang II和ACEmRNA及蛋白质的表达。结果: 银屑病患者皮损中Ang II和ACE mRNA及蛋白质的表达明显高于正常人对照组(P＜0.001),且进行期高于静止期(P＜0.001)。结论: Ang II和ACE在银屑病皮损中表达上调,推测可能与银屑病皮损中新血管的形成有关。

银屑病； 血管紧张素II； 血管紧张素转化酶

银屑病是一种常见的慢性易复发炎症性皮肤病,新生血管形成是银屑病重要的病理特征之一。1近年有学者对肾素－血管紧张素系统(rennin－angiotensin system,RAS)在皮肤组织的表达进行了研究,Ang II可促进血管内皮生长因子VEGF表达,进而导致新生血管形成、血管通透性增加,曾有报道使用血管紧张素受体拮抗剂及血管紧张素转化酶抑制剂可诱发或加重银屑病病情。2,3本研究通过检测寻常型银屑病患者皮损中Ang II和ACE mRNA和蛋白质的表达水平,进而明确两者与寻常型银屑病发病的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 研究病例 2009年1～9月在我院门诊及广州市皮肤病防治所就诊的寻常型银屑病患者30例,均经临床与组织病理检查确诊,其中男18例,女12例,年龄16～73岁,平均39岁,病程1个月～10余年。银屑病患者的皮损面积和严重程度按PASI评分为4.2～33.7分,平均13.45±6.42分。所有银屑病患者近3个月内未系统服用维A酸﹑糖皮质激素﹑免疫抑制剂等药物,2周内未使用任何外用药物。

1.1.2 标本收集 所有患者常规皮损活检,取材部位为腰背部及四肢。对照组15个标本来源于我院整形外科门诊手术,其中男8名,女7名,年龄与银屑病患者组相当,均排除银屑病且无系统性疾病和其他皮肤病。

1.2 检测方法

1.2.1 荧光定量PCR(FQ－PCR) 应用FQ－PCR检测30例寻常型银屑病患者皮损(进行期17例,静止期13例)和15名正常人皮肤中Ang II、ACE mRNA的表达情况。

1.2.1.1 FQ－PCR引物探针设计 序列如下Sequence Name:H－Ang II(77 bp)；Forward Primer:5'－GCCACTATGGGCTGTCTACACA－3'；Reverse Primer:5'－TGGCTGAAGCAATCTTACATAGGT－3'；Probe:5'－FAM－TATGGAATACCGCTGGCCCTTTGGC－TAMRA－3'；Sequence Name:H－ACE(68 bp)；Forward Primer:5'－CCGAAATACGTGGAACTCATCAA－3'；Reverse Primer:5'－CACGAGTCCCCTGCATCTACA－3'；Probe:5'－FAM－CAGGCTGCCCGGCTCAATGG－TAMRA－3'。

1.2.1.2 组织RNA的提取 组织块置匀浆器,加TRIZol(Invitrogen公司)1 mL,冷冻匀浆,依据说明书上的步骤提取RNA。

1.2.1.3 RNA样品鉴定 浓度计算:每样品在紫外分光光度计(日本SHIMADZU UV mini 1240)上测定波长为260 nm时的吸光度值。浓度计算公式:浓度(g/ L)＝OD260×稀释倍数(120倍)×40/1000。

1.2.1.4 逆转录反应 取4μLRNA模板进行逆转录反应,仪器为PE9700PCR仪(美国Perkin Elmer公司),反应体系如下:5×逆转录buffer 4μL；上游引物(10 pM/μL)0.4μL；下游引物(10 pM/μL)0.4μL；dNTPs(25 mM)0.2μL；MMLV(10 U/μL)1μL；DEPC水10μL；RNA模板4μL；总体积:20μL；(逆转录buffer成分:50 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,4 mM MgCl2,10 mM DTT)。反应条件:37℃1 h,95℃3 min。

1.2.1.5 荧光定量PCR反应 样本按以下反应体系进行:5×定量PCR buffer(美国ABI公司)10μL；上游引物F(10 pM/μL)1μL；下游引物R(10 pM/μL)1 μL；dNTPs(25 mM)(Sigma公司)0.5μL；荧光探针(10 pM/μL)1μL；Taq酶(美国ABI公司)1.5μL；cDNA 5μL；ddH2O 30μL；总体积:50μL。

PCR buffer成分:10 mM Tris－HCl(pH 8.0),50 mM KCl,2mM MgCl2；反应条件为:93℃2 min,93℃45 s,55℃45 s,共40循环。

1.2.2 免疫组化SABC法检测Ang II、ACE蛋白的表达情况 倒置OLYPUS显微镜摄像:应用KONTRON IBAS 2.5(德国)全自动图像分析系统,参照文献4所提供的免疫组化的定量方法,应用ZEISS Axiotron研究型显微镜,每张切片选取5个具有代表性的100倍视野,测出测试区域A的灰度级GA和面积(m＋n)及阳性反应产物α相的灰度Gα和面积n。计算各视野阳性指数(positive unit,PU),PU＝100×｜Gα－GA｜/〔(1－AAa)Gmax〕,其中Gmax为图像分析系统的最大灰度级(其值为256),以平均值作为该标本的阳性系数值进行分析。

1.3 统计学方法 所得数据用(¯x±s)表示,应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。统计学方法包括t检验、t'检验和直线相关分析,组间比较均先进行正态性检验,若资料不符合正态分布,则应用非参数检验,求相关系数(r)并作显著性检验。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 银屑病患者皮损细胞内Ang IImRNA的表达水平明显高于正常对照者中的表达水平(P＝0.002),见表1。

2.2银屑病患者皮损细胞内ACE mRNA的表达水平明显高于正常对照者中的表达水平(P＝0.002),见表2。

2.3 Ang II蛋白及ACE蛋白在银屑病皮损及正常对照组皮肤中的表达 寻常型银屑病患者皮损中Ang II及ACE蛋白含量较对照组明显增高(P＜0.001)；进行期与静止期患者皮损的Ang II及ACE蛋白表达差异有显著性(P＜0.001),见表3。

表1 银屑病皮损和正常人皮肤内Ang IImRNA的表达

表2 银屑病皮损和正常人皮肤内ACE mRNA的表达

表3 Ang II、ACE蛋白在银屑病各组和正常组中的表达

3 讨论

近年来有报道Ang II及ACE与银屑病的发病有关,5在人表皮细胞(角质形成细胞、黑素细胞、表皮成纤维细胞和表皮血管内皮细胞)均有Ang II受体的表达,Ang II对各种表皮细胞的增殖和分化起重要作用。6本研究发现在银屑病患者皮损血管内皮细胞和角质形成细胞中均表达Ang II,尤其是基底层及棘细胞层高度表达,表达量高于正常人。目前认为Ang II通过促进VEGF、内皮素－1、前列腺素D2等分子的表达而增加血管通透性,引起内皮细胞增殖并有新血管形成,从而诱发或加重银屑病。2,3至于Ang II及VEGF在银屑病中表达量的相关性及与其他致炎因子之间的相互作用有待进一步研究。本次实验表明,银屑病患者皮损中的ACE表达显著高于正常人,且进行期和静止期表达量差异有显著性,表明ACE与银屑病病情轻重程度具有相关性。ACE是皮肤炎症如银屑病或过敏性皮炎的重要监控因子,7能有效控制皮肤感觉神经末稍释放的神经肽,并清除这些神经肽类物质和生长因子的蛋白裂解产物,银屑病皮损区神经支配密度高于非皮损区及正常对照,且神经纤维显著增长,P物质含量显著增高。8进而诱导致炎因子的释放,ACE作为这些致炎因子及神经肽类物质的监控因子,其水平随之也增高。

1 Creamer JD,Barker JN.Vascular proliferation and angiogenic factors in psoriasis.Clin Exp Dermatol,1995,20(1):6－9.

2 Antonor D,Grozdev I,Pehlivanov G,et al.Psoriatic erythroderma associated with enalapril.Skinmed,2006,5(2):90－92.

3 Cohen AD,Bonneh DY,Reuveni H,et al.Drug exposure and psoriasis vulgaris:case－control and case－crossover studies.Acta Derm Venereol,2005,85(4):299－303.

4申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(III).中国组织化学与细胞化学杂志,1995,4(1):89－91.

5Cambien F,Alhence－Gelas F,Herbeth B,et al.Familial resemblance of plasma angiotensin－converting enzyme level:the Nancy Study.Am JHum Genet,1998,43(5):774.

6 Das UN.Is angiotensin－IIan endogenous pro－inflammatorymolecule.Med SciMonit,2005,11(5):155－162.

7 Scholzen TE,Luger TA.Neutral endopeptidase and angiotensinconverting enzyme－key enzymes terminating the action of neuroendocrinemediators.Exp Dermatol,2004,13(Suppl,4):22－26.

8Eedy DJ,Johnston CF,Shaw C,etal.Neuropeptides in psoriasis:an immunocytochemical and radioimmunoassay study.Invest Dermatol,1991,96(4):43－48.

(收稿:2012－10－31 修回:2013－04－15)

The expression of angiotensin II and angiotensin converting enzyme in patien tsw ith psoriasis

CAIYan-xia,CAIChuan-chuan,Fan Yi-ming,et al.Guangdong Medical College Affiliated Hospital,Guangdong,Zhanjiang,524001

Objective:To detect the level of angiotensin II(Ang II)and angiotensin converting enzyme (ACE)in patientswith psoriasisvulgaris.Methods:The levelof Ang IIand ACEwas detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ－PCR)and immunohistochemistry technique in 30 patients with psoriasis vulgaris(progressing stage in 17 cases and stable stage in 13)and 15 normal controls.Results:The level of Ang IIand ACE protein was significantly higher in psoriatic lesions than in controls(P＜0.001)and in progressing stage higher than in stable stage(P＜0.001).Conclusion:Over expression of Ang IIand ACE in psoriatic lesionsmay be implicated in the neovascularization of psoriasis.

psoriasis；angiotensin II；angiotensin converting enzyme

1广东医学院附属医院皮肤科,广东湛江,524001

2广州市皮肤病防治所,广东广州,510095