益生菌治疗成人特应性皮炎疗效评价

姜丽亚 郭 震 戴景斌 赵炳波

益生菌治疗成人特应性皮炎疗效评价

姜丽亚 郭 震 戴景斌 赵炳波

目的: 评价益生菌治疗成人特应性皮炎(AD)的疗效。方法: 40例AD患者随机分为A组和B组,A组给予抗组胺药、0.05%地奈德乳膏及益生菌制剂,B组仅给予抗组胺药和0.05%地奈德乳膏,两组均治疗12周。20名健康者作为对照。治疗前、后及治疗后2个月用SCORAD和VAS法进行病情评分,并用PCR荧光定量法检测受试者粪便中的细菌水平。结果: 治疗结束时,A组、B组评分较治疗前均显著降低(P＜0.01)；停药2个月时,A组评分仍低于治疗前(P＜0.01),而此时B组评分与治疗前相比无统计学差异。治疗前A、B组双歧杆菌及乳酸杆菌的数量明显低于健康对照组(P＜0.01)。治疗结束及停药2个月时,A组两种杆菌较治疗前均显著增加(P＜0.01),B组两种杆菌较治疗前均无显著差异。结论: 益生菌可通过增加肠道双歧杆菌及乳酸杆菌菌群而改善病情并延缓复发。

肠道菌群； 特应性皮炎； 益生菌

近年来,特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)肠道菌群状况异常与AD的关系受到重视,有研究报道婴幼儿AD存在肠道微生物菌群失调,益生菌在预防和治疗儿童过敏性疾病(如AD)有效。1,2但目前对益生菌治疗成年AD的研究较少,本实验对成年AD患者的肠道菌群状况及益生菌对该病疗效进行了研究。

1 材料与方法

1.1 病例资料 我院皮肤科门诊就诊的37例AD患者入选本实验,均符合Hanifin和Rejka AD诊断标准；3无其他伴发症及系统疾病,治疗前2周内未外用糖皮质激素治疗；1个月内未系统使用过糖皮质激素；6个月内未系统使用过益生菌、抗生素、环孢素或中药治疗,随机分为A组和B组。A组19例:男9例,女10例,年龄19～42岁,平均32.21±1.46岁,病程14～43年,平均30年；B组18例:男10例,女8例,年龄19～44岁,平均30.71±2.06岁,病程14～42年,平均31年。本院体检的健康人20名作为正常对照,男11名,女9名,年龄20～43岁,平均31.67±1.89岁。对照组排除过敏性哮喘,过敏性结膜炎,食物过敏等过敏性体质者。A、B组及健康对照组在性别、年龄方面具有可比性。

1.2 治疗方法 A组给予抗组胺药、0.05%地奈德乳膏及益生菌制剂:益生菌选用双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(国药准字S19980004),成分为长型双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌,4片/次,日3次,共12周。B组患者给予抗组胺药及0.05%地奈德乳膏。治疗期间,避免含有任何活菌的发酵食品,避免系统应用抗生素。治疗前后所有患者均进行血常规、尿常规及肝肾功能检测。

1.3 临床疗效判定 在治疗前后、停药2个月时进行SCORAD和VAS评分,评价疗效。

采用SCORAD计分系统对AD皮损及临床严重度进行评估,4包括皮肤病变范围(A)、皮肤严重程度(B)、瘙痒和睡眠影响程度(C)。A:成人头颈部、臀部各9%,躯干前后各13.5%,下肢各22.5%；14岁以下儿童头颈部、臀各9%,躯干前后及下肢各18%,1%面积为1分。B:按上述部位0～3四级评分,症状、体征包括红斑、丘疹或水肿、表皮剥脱、裂纹或皲裂、渗出或结痂、苔藓化、皮肤干燥(评未受累皮肤)。C:按最近3昼夜平均评分,0～3四级评分法,总分＜15分为轻度；15～40分为中度；＞40分为重度。

采用视角模拟尺度分法(visual analogue scale, VAS)对瘙痒程度进行评价:用长度为10 cm的标尺,两端10～0分别代表最痒至不痒,让患者将游标放置在能代表其瘙痒程度的位置上,医生读出评分结果。

1.4 肠道菌群检测

1.4.1 实验材料和仪器 恒温培养振荡器ZHWY－2102C(上海智城分析仪器制造有限公司),－80℃超低温冰箱(美国Thermo Forma公司),H fsafe－1200TE全排型生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司),超净工作台VS－1300L－U(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司),低温离心机Sigma 3K15(Sigma公司),电热恒温水浴锅HH－S(上海比朗公司),纯水器(法国Milipore公司),移液器(德国Eppendorf公司),核酸蛋白检测仪Nanodrop 2000(Thermo公司),9700基因扩增仪(美国Applied Biosystems公司),电泳仪(Bio rad公司)及凝胶成像分析系统2200(美国阿尔法公司)。DNA分子标准marker(LIFE SCIENCE公司), TAE缓冲液(上海创赛科学仪器有限公司)等。普通DNA产物纯化试剂盒(离心柱型)、细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、荧光染料(SYBR Green I)、TaqDNA多聚酶等均购自北京天根生物公司。标准菌株ATCC29212(粪肠球菌)、ATCC25922(大肠杆菌)、引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

1.4.2 粪便标本的采集 分别取AD患者治疗前后、停药2个月时及健康对照者的新鲜粪便,用天平称取中段大便,每例取500mg,提取粪便细菌DNA,－20℃保存备用。PCR荧光定量检测粪便内的乳酸杆菌,双歧杆菌,大肠杆菌,粪肠球菌,屎肠球菌含量。

1.4.3 检测方法 分别提取2种标准菌株ATCC29212(粪肠球菌)、ATCC25922(大肠杆菌)和3例正常对照者粪便中屎肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌基因组DNA进行常规PCR反应,取PCR反应产物电泳检测引物的特异性；取上述5种细菌的基因组DNA进行特异性扩增、纯化、稀释、定量,制作标准曲线,以便为待测样品的定量提供参照标准。将其余粪便标本中提取的DNA分别进行5种细菌的实时荧光定量PCR反应,反应体系:荧光染料9μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O 7μL,加石蜡油8μL,反应体积为20μL。反应条件:95℃预变性2 min,95℃变性20 s,双歧杆菌57℃、乳酸杆菌58℃、大肠杆菌59℃、粪肠球菌60℃、屎肠球菌61℃退火30 s,68℃延伸30 s,40个循环,74℃延伸1 min。每次实验同时设标准品校正和ddH2O代替DNA模板作为阴性对照。反应完毕后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性,并由PCR仪分析定量结果,每份粪便标本所含的5种细菌的拷贝数可通过循环数与标准曲线比较得到。结果以每克湿便的细菌拷贝数的对数(以10为底数)表示。

1.5 统计学方法 实验数据以¯x±s表示,数据分析应用SPSS 18.0软件,进行t检验及方差检验,P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 SCORAD和VAS评分结果 见表2。

2.2 荧光定量PCR检测5种肠道细菌数量结果 见表3。引物特异性检测结果及溶解曲线(单峰)均证明扩增产物单一。

表1 5种细菌的PCR扩增引物序列

表2 治疗前后SCORAD和VAS评分比较

表3 各组粪便标本细菌定量检测结果

2.3 不良反应 治疗期间两组患者均未见血、尿常规及肝肾功能异常及其它不良反应。

3 讨论

肠道益生菌在诱导免疫耐受、抑制过敏性疾病的发生和改善症状方面起着重要的作用,婴幼儿AD患者存在肠道菌群状况异常。2,5本试验结果提示成年AD患者也存在肠道菌群失调的情况,主要为双歧杆菌及乳酸杆菌的数量明显减少,而大肠杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌的数量则无明显变化。Roessler等6进行了一项随机双盲对照研究,结果显示意大利成人AD病患组较健康组粪便乳酸杆菌数量降低,与我们的结果一致,但双歧杆菌的数量与健康人无统计学差异,与本研究结果不同,这可能与两研究间检测方法、欧亚地区人种及饮食习惯不同有关。

益生菌是一类定居在肠道中的有益细菌,有助于改善肠道免疫屏障功能、调节机体的免疫反应、降低肠道炎症反应。益生菌对预防、治疗过敏性疾病有效,可以减轻AD和牛奶过敏儿童的皮肤及肠道炎症。7,8本试验结果显示,口服益生菌12周能明显上调AD患者肠道中双歧杆菌及乳酸杆菌的数量,停药后2个月时上述2种细菌的数量仍可以维持在正常水平,同时非益生菌组患者仅在治疗结束时SCORAD和VAS评分较治疗前改善,好转原因考虑与基础用药(抗组胺药物及外用药物)对病情改善有关,但停药后2个月时病情有反复；益生菌组的患者在经过12周的益生菌及常规治疗后SCORAD和VAS评分均较治疗前明显改善,且停药后2个月病情无明显反复,考虑与口服益生菌改善肠道内环境、加强肠道免疫屏障功能、减轻菌群失调所致的变态反应有关。

本实验结果表明,成年AD患者的肠道菌群与正常人群存在差异；口服益生菌可改善AD患者的肠道菌群,且无明显不良反应,可为过敏性疾病的防治提供有效的途径。但本实验样本量较小,今后开展多中心、大样本、双盲对照研究,将会更全面地反映成人AD患者肠道菌群的情况及益生菌治疗AD的疗效及机制。

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3 Hanifin JM.Diagnostic criteria for atopic dermatitis:consider the context.Arch Dermatol,1999,135(12):1551.

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5Kabashima K.New conceptof the pathogenesis of atopic dermatitis:interplay among the barrier,allergy,and pruritus as a trinity.JDermatol Sci,2013,70(1):3－11.

6 Roessler A,Forssten SD,GleiM,et al.The effect of probiotics on faecalm icrobiota and genotoxic activity of faecalwater in patients with atopic dermatitis:a randomized,placebo－controlled study.Clin Nutr,2012,31(1):22－29.

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(收稿:2014－01－18 修回:2014－02－08)

Assessment of efficacy of probiotics in the treatment of atopic dermatitis

JIANG Li-ya,GUO Zhen,DAIJing－bin,etal.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng,252000

Objective:To evaluate clinical efficacy of probiotics for the treatment of adult AD patients.Methods:Forty patientswere enrolled in thisstudy and divided into two groups:the patients in the probiotics group were treated with antihistamine,topical steroid and probiotics.The patients in the non－probiotics group were treated with antihistamine and topical steroid only.The course of the treatment was 12 weeks.Twenty healthy peop le were used as control.The disease severity was assessed by SCORAD and VAS score at baseline,week 12 and month 2 after stopping the treatment.The change in fecalmicrobiota was detected by PCR.Results:The SCORAD and VAS scoreswere significantly reduced in the two groups(P＜0.01)after the treatment,compared with those before the treatment.Atmonth 2 after stopping the treatment,the SCORAD and VAS scores continued to be lower than those atbaseline in the probiotics group(P＜0.01),but not in the non－probiotics group.Before the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli in stool of the two groupswas higher than that in the healthy control(P＜0.01).At end of the treatmentand month 2 after stopping the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli was significantly increased(P＜0.01)in probiotics group,rather than in non－probiotics group.Conclusion:Probiotics can improve the clinical status of the disease through increasing the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli,and prolong relapse of AD.

intestinal flora；atopic dermatitis；probiotics

山东省聊城市人民医院,聊城,252000