等电点沉淀结合凯氏定氮法测定市售纯牛奶中酪蛋白的含量

孙雯，李宏梁，*，魏莉娟，曹吉利，谭源，惠笑

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021；2.西安产品质量监督检验院，陕西西安710065；3.西安东方乳业有限公司，陕西西安710028）

等电点沉淀结合凯氏定氮法测定市售纯牛奶中酪蛋白的含量

孙雯1，李宏梁1，*，魏莉娟2，曹吉利3，谭源3，惠笑1

（1.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021；2.西安产品质量监督检验院，陕西西安710065；3.西安东方乳业有限公司，陕西西安710028）

在酪蛋白测定方法的前期研究基础上，对等电点沉淀法进行改进，结合凯氏定氮法对市售纯牛奶中的乳蛋白组分进行了测定。确定了制备纯品酪蛋白的最佳洗涤剂和洗涤次数，NaOH溶液碱复溶酪蛋白等电点沉淀物最佳添加范围。实验结果表明，改进后的等电点沉淀方法，测定酪蛋白质量分数都在74%～76%。pH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液作为洗涤剂，对于体系pH的维持更加稳定。仅沉淀的处理方式可以将大部分乳清蛋白和酪蛋白进行分离。NaOH溶液最佳添加范围是25mL～35mL。改进后的等电点沉淀结合凯氏定氮法高效准确，简单易行，重现性好，可以用于纯牛奶中酪蛋白的掺假鉴定。

牛乳；掺假；碱复溶酪蛋白；等电点沉淀法；凯氏定氮法

近年来，我国乳品安全事件频频发生，最主要的问题是乳品掺假问题和抗生素残留问题。而乳品掺假问题的间接原因是因为我国乳品安全国家标准的缺失——缺乏检验乳品掺假的正确指标和检验方法[1]。乳制品安全的核心是乳源蛋白质的检测，目前通用的蛋白质检测方法“凯氏定氮法”，即通过测出含氮量来估算蛋白质含量。由于蛋白质检验方法的缺陷和落后，因此添加乳清粉、食用明胶和三聚氰胺等可以增加牛奶蛋白质的检测指标，从而使掺假食品通过食品检验机构的检测[2]。随着国家对乳品安全事件的关注，也出台了相关政策和检测方法，但这些检测方法大多是专一性的，不具有广泛性。为此，急需建立具有广泛性、快速、准确的掺假检测方法，以确保乳制品的质量和安全。

牛奶中酪蛋白含量约为2.6 g/100mL，酪蛋白质量分数一般稳定在77%～78%，且对于同一品种的奶牛，很少受季节、饲料等的影响。因此，牛奶中酪蛋白含量可作为一个定性、定量的质量指标，来判断牛奶质量优劣和是否掺假[3]。

通过对国内外酪蛋白测定方法[4-8]的研究比较，发现等电点沉淀法是一种常见的、简单易行的乳品安全常规检验方法，但一方面该方法在操作步骤上，（1）需要经过酸沉、离心、复杂的洗涤过程和长时间的干燥过程，才能得到纯品酪蛋白沉淀；（2）烘干后样品形状很坚硬，只能通过称量的方式测定酪蛋白含量，无法直接刮下来测定蛋白；（3）洗涤过程仅可以除去了大部分的水溶性杂质和脂类物质，所测得的纯品酪蛋白干物质中还含有很多杂质没有除去，其测定值会偏高。另一方面该检测方法在实际应用上未见同时对沉淀物与上清液含氮量测定的研究报道，即未见验证酪蛋白和乳清蛋白相加得到的理论蛋白质含量与实际测定的总蛋白质含量是否存在较大误差。针对操作缺陷，研究了洗涤次数对酪蛋白含量测定的影响，同时采取了NaOH溶液碱复溶酪蛋白等电点沉淀物的可行改进方法，有利于沉淀物的准确取样；针对应用缺陷，本研究同时测定了市售纯牛奶中的酪蛋白、乳清蛋白和总蛋白，并对测定值进行了准确性误差对比。

通过反复试验对比，本实验确定的纯牛奶酪蛋白沉淀测定方法的技术路线是，准确吸取纯牛奶样品，采用等电点沉淀纯牛奶，所得沉淀物用NaOH溶液碱复溶酪蛋白沉淀物，上清液用pH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液定容，用凯氏定氮法分别对纯牛奶、酪蛋白和乳清蛋白进行测定，最终得到样品中酪蛋白质量分数，以此判断乳品掺假行为。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

主要原料：227mL利乐枕银桥纯牛奶：西安银桥生物科技有限责任公司生产，标签标示的蛋白质含量≥2.9 g/100 g。

主要试剂：10%乙酸溶液、pH 4.6醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、400 g/L氢氧化钠溶液、20 g/L硼酸溶液、0.094 7mol/L盐酸标准滴定溶液。

1.2 仪器与设备

BS323s电子天平（精确度0.001g）、PB-10酸度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；ES 35B-Pro磁力搅拌器；中佳牌高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；Hanon半自动凯氏定氮仪、Hanon石墨消化仪：济南海能仪器有限公司；大龙牌移液枪（5mL）：大龙兴创实验仪器有限公司；天玻牌移液管（10mL）：天津市天科玻璃仪器制造有限公司；烧杯（100mL）；锥形瓶（250mL、300mL）；洗耳球；离心管（50mL）；容量瓶（100mL）；量筒（50mL）。

1.3 方法

1.3.1 等电点沉淀法的工艺改进

1.3.1.1 等电点沉淀法分离乳蛋白

准确吸取20mL奶样于100mL烧杯中，烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌同时用10%的乙酸溶液调节样品的pH到4.60，然后将样品转移到50mL离心管中，用5mL pH 4.6 HAc-NaAc缓冲溶液洗涤烧杯。将离心管放入离心机，5 000 r/min离心15min，将上清液倒入100mL容量瓶中，并记录上清液体积。所得沉淀物用pH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液洗涤两次，分别在上述条件下离心，倒出上清液于50mL离心管中。调节洗涤后上清溶液pH到4.60，5 000 r/min离心10min，分离合并3次上清液，用pH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液定容至100mL，得到乳清蛋白稀释液。称量沉淀物质量后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液复溶3个离心管中的沉淀物，混匀后合并，得到酪蛋白复溶溶液。酪蛋白复溶溶液和乳清蛋白稀释液作为待测样品，备用。

1.3.1.2 半自动凯氏定氮仪测定乳蛋白

向消化管中加入4.500 g催化剂（硫酸钾∶硫酸铜=9∶1）。准确吸取酪蛋白复溶溶液2mL于消化管内，记录质量，精确到0.1 g。加入10mL浓硫酸于消化管内，在420℃消化1.5 h。静置待消化管冷却后，进行蒸馏，收集蒸馏液于加入30mL 2%硼酸溶液液的250mL的锥形瓶中。将蒸馏液全部移入300mL锥形瓶内，蒸馏水洗涤，用0.094 7mol/L盐酸标准滴定溶液进行滴定，记录消耗盐酸标准溶液的体积，酪蛋白含量参考公式（1）、（2）。其中纯乳的的氮换算为蛋白质的系数F为6.38。平行实验，同时做试剂空白实验。

准确吸取乳清蛋白稀释液20mL于消化管内，记录质量，用同样的方法测定乳清蛋白含量。乳清蛋白含量参考公式（1）、（3）。其中纯乳的的氮换算为蛋白质的系数F为6.38。平行实验，同时做试剂空白实验。

准确吸取奶样1mL于消化管内，记录质量，用同样的方法测定总蛋白含量。总蛋白含量参考公式（1）。其中纯乳的的氮换算为蛋白质的系数F为6.38。平行实验，同时做试剂空白实验。

酪蛋白质量分数参考公式（4）。

1.3.2 纯品酪蛋白的制备条件的研究

1.3.2.1 洗涤剂的确定

洗涤剂采用蒸馏水和pH 4.6 HAc-NaAc缓冲溶液，对样品在整个处理过程的pH进行监测。

1.3.2.2 洗涤次数的确定

本研究采用“仅沉淀、洗涤1次、洗涤2次”3种不同的前处理方式，观察上清液、调节上清pH后再沉淀和测定其乳蛋白含量。

1.3.3 酪蛋白沉淀复溶样品的制备

分别向酪蛋白沉淀中加入10、15、20、25、30、35、40mL的0.1mol/LNaOH溶液，混匀后测定酪蛋白含量。

2结果与分析

2.1 等电点沉淀法的工艺改进

处理1实验参数：3 000 r/min离心15min，蒸馏水作为洗涤剂，10mL 0.1mol/LNaOH溶液复溶。表1是处理1方式下，测定的纯牛乳中乳蛋白含量。

表1 处理1测定纯牛奶中乳蛋白含量Table1 M ilk protein content in pure milk determined by processing method 1

该处理方式的酪蛋白质量分数都在61%以上，平均酪蛋白含量为2.02 g/100 g，乳清蛋白含量为1.15 g/100 g，酪蛋白质量分数为63.02%，乳清蛋白质量分数为35.83%。经过前期研究，验证了牛乳掺假检验的定性定量指标：酪蛋白质量分数≥73%，所以该处理方式仍需改进。

分析发现，处理1中存在以下问题：（1）离心后，上清中总存在着沉淀颗粒，主要是由于酪蛋白胶粒的完全沉降需要足够的速度和足够的时间。（2）洗涤剂蒸馏水，会使得上清液中的pH发生变化，偏离酪蛋白的等电点，使部分酪蛋白沉淀复溶，随上清液流失。（3）在复溶过程中，复溶效果不佳，一方面可能是NaOH添加量不足，另一方面是混匀方式不当，导致复溶后，溶液中存在着未完全复溶的酪蛋白沉淀颗粒。

根据处理1发现的问题，对等电点沉淀方法进行了改进。处理2实验参数：5000 r/min离心15min，pH 4.6 HAc-NaAc缓冲溶液作为洗涤剂，（15+10）mL 0.1mol/L NaOH溶液复溶，其中15mLNaOH溶液直接加入到洗涤后的沉淀中，另外10mLNaOH溶液分别加入到两个洗涤后分离了上清液的离心管中，复溶其中残留的少量酪蛋白沉淀。表2是处理2方式下，测定的纯牛乳中乳蛋白含量。

表2 处理2测定纯牛奶中乳蛋白含量Table2 M ilk protein content in pure milk determined by processing method 2

改进后的方法酪蛋白质量分数都在74%～76%，均大于73%。平均酪蛋白含量为2.33 g/100 g，乳清蛋白含量为0.38 g/100 g，酪蛋白质量分数为75.06%，乳清蛋白质量分数为12.17%。

图1为处理2测定的纯牛乳中酪蛋白、乳清蛋白质量分数。从图中可以看出，该处理方法所得数据的重现性和稳定性较好。

图1 处理2测定纯牛奶中乳蛋白含量Fig.1 Milk protein content in puremilk determined by processing method 2

处理1和处理2的结果进行对比，结果表明，处理2方法大大提高了酪蛋白的提取率，从而提高了酪蛋白质量分数，同时提高了该方法的准确性和精确性。

2.2 纯品酪蛋白制备条件的研究

等电点沉淀后分离得到的酪蛋白沉淀即粗品酪蛋白沉淀，纯品酪蛋白的制备是通过洗涤的方式，除去酪蛋白分子中夹杂的乳清蛋白，提高酪蛋白的分利率。

2.2.1 洗涤剂的确定

两种洗涤剂对体系pH的影响见表3。

由表3可以看出，pH 4.6 HAc-NaAc缓冲溶液对于体系pH的维持更加稳定。故洗涤剂选用pH 4.6 HAc-NaAc缓冲溶液。

表3 两种洗涤剂对体系pH的影响Table3 Two kinds of detergent effect on pH of system

2.2.2 洗涤次数的确定

洗涤次数对乳清蛋白感官的影响见表4，洗涤次数对乳蛋白含量的影响见表5。

表4 洗涤次数对乳清蛋白感官的影响Table4 W ashing times effect on whey sensory

表5 洗涤次数对乳蛋白含量的影响Tab le5 W ashing times effect on milk protein content

从表4中可以发现，仅沉淀处理下，乳清蛋白上清液最为澄清，且其中几乎不含有酪蛋白沉淀。从表5中可以得出，（1）随着洗涤次数增多，酪蛋白含量下降；（2）相同处理条件下，酪蛋白含量相似。一方面因为随着洗涤次数增多，有部分沉淀带到离心管壁上，且离心过程中，酪蛋白胶粒未能完全沉降，游离在上清液中，随上清液流失；另一方面因为经沉淀处理后，酪蛋白中仍可能存在着一些乳清蛋白未洗涤出来。故仅沉淀的处理方式可以将绝大部分乳清蛋白和酪蛋白进行分离。

2.3 酪蛋白沉淀复溶样品的制备

通过实验发现，NaOH添加量越高，复溶效果越好。但当添加量大于25mL，复溶效果差异大。采用旋涡混匀结合超声的方式复溶，费时且总会有小颗粒固体沉淀未溶解。

3结论和建议

1）改进后的等电点沉淀测定方法，酪蛋白质量分数都在74%～76%，均大于73%，可以有效的提高检测的准确度，且该方法的精密度都有了显著提高。

2）pH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液较蒸馏水作为洗涤剂，对于体系pH的维持更加稳定。

3）3种洗涤方式的对比，仅沉淀的处理方式可以将大部分乳清蛋白和酪蛋白进行分离。采用该方法处理样品，大大简化了实验操作步骤，方便易行。

4）本研究确定的酪蛋白沉淀复溶样品制备方法是，向酪蛋白沉淀中加入0.1mol/L的NaOH溶液25mL～35mL，用旋涡混匀器进行混合，然后超声30min，即得酪蛋白沉淀复溶溶液。

5）本研究确定的纯牛奶中酪蛋白沉淀测定方法是，准确称量20mL奶样于100mL烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌同时用10%的乙酸溶液调节样品的pH到4.6，然后将样品转移到50mL离心管中，用5mLpH 4.6HAc-NaAc缓冲溶液洗涤烧杯，移液于离心管中。将离心管放入离心机，5 000 r/min离心15min，用25mL～35mL 0.1mol/LNaOH溶液碱复溶酪蛋白沉淀物，用旋涡混匀器进行混合，超声30min，即得酪蛋白沉淀复溶溶液。最后用凯氏定氮法分别对酪蛋白复溶溶液、纯牛奶进行含氮量测定，通过两者的比值得到样品中酪蛋白质量分数，以此判断纯牛奶真实性问题。

[1]李宏梁,黄峻榕,李红,等.酪蛋白质量分数作为乳品掺假检验指标的探讨[J].中国乳品工业,2008,36(1)：52-54,62

[2]李宏梁,焦茜楠,黄峻榕,等.酪蛋白沉淀检测方法机器在牛乳经济掺假鉴定中的应用[J].食品科技,2008,33(12)：262-266,267

[3]丁慧.酪蛋白质量分数作为乳品掺假鉴定指标的研究[D].陕西：陕西科技大学,2010

[4]张芳,李红旭.影响牛乳酪蛋白分离因素的研究[J].保鲜与加工, 2006,34(3)：29-31

[5]张东送,庞广昌,高法国,等.毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含量测定及掺假检测方面的应用[J].食品与发酵工业,2005,30(1)：130-132

[6]程涛,孙艳波,李健.双缩脲法测定乳中酪蛋白含量[J].中国乳品工业,2000,28(3)：33-35

[7]Dion M A M Luykx,Jan H G.Cordewener,et al.Identification of plant proteins in adulterated skimmed milk powder by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2007,1164(1/2)：189-197

[8]卫生部食品卫生监督检验所.GB 5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京：中华人民共和国卫生部, 2010：1-4

Determination of Casein in Pure M ilk from M arket by Isoelectric Precipitation Combined w ith the Kjeldahl Method

SUNWen1，LIHong-liang1，*，WEILi-juan2，CAO Ji-li3，TANYuan3，HUIXiao1
（1.Collegeof Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China；2.Xi'an Supervision and Inspection Institute of Product Quality，Xi'an 710065，Shaanxi，China；3.Xi'an OrientalDairy Co.，Ltd.，Xi'an 710028，Shaanxi，China）

Based on the preliminary studies of measuring casein content，isoelectric point precipitation process was improved，combined with the Kjeldahl method to determine milk protein components in pure milk from market.The purpose was to determine the optimum detergent and washing times of preparation conditions of pure casein and the addition range of NaOH solution.Experimental results show that the casein contentsof the samples were in 74%to 76%in the improved way.It's more stable for the system to use pH 4.6 HAc-NaAc buffer solution as detergent.Mostwhey and casein could be separated without washing process.The optimum addition range of NaOH solution was25mL to35mL.The improved method was efficient，accurate，simple，workable and reproduce dwell.This test method could identify the adulteration of casein in pure milk.

milk；adulteration；alkaline casein；isoelectric precipitation；Kjeldahl method

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.025

2014-04-29

西安市农业推进计划项目（NC1208（3））

孙雯（1990—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：食品检验与食品安全。

*通信作者