利用基因组编辑技术创制抗白粉病小麦

王延鹏, 程曦, 高彩霞, 邱金龙

1.中国科学院遗传与发育生物学研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北京100101;

2.中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室, 北京 100101

普通小麦(Triticum aestivumL., 2n=42, AABBDD)是异源六倍体, 是世界上最重要的粮食作物之一, 为人类提供约20%的能量。由于其基因组庞大(17 Gb), 约为人类基因组的5倍, 并且80%～90%的基因都存在3个或多个拷贝, 因此利用传统的正向或反向遗传学手段来解析小麦基因功能以及作物的性状改良都有很大的难度, 这使得小麦基因组研究远远落后于其他作物。随着小麦基因组测序的逐步完成, 建立一种高效的反向遗传学手段将成为小麦基因组功能解析和作物改良的关键。基因编辑技术是目前突变或改造基因的最具潜力的技术体系, 特别是类转录激活效应因子核酸酶(TALENs)和成簇规律间隔的回文重复序列及相关系统(CRISPR/Cas9 system), 具有效率高、特异性好以及高通量的特点。

在小麦里解析与其亲缘关系较近物种中控制重要性状基因的同源基因功能是反向遗传学研究的主要内容, 有助于对小麦中相应性状的遗传改良。小麦和大麦具有较近的亲缘关系, 白粉病是大麦和小麦主要的世界性病害, 严重的影响到他们的产量和品质。大麦里由于MLO基因的功能缺失突变使其具有广谱和持久的抗性, 这种抗性在生产上已成功应用了30多年还没有被打破。在小麦中也存在MLO基因,在小麦 A、B、D基因组上各有一个拷贝(TaMLO-A1,TaMLO-B1,TaMLO-D1), 它们与大麦的MLO基因具有很高的相似性。将TaMLO-B1转入大麦MLO基因的突变体里, 可使其恢复对白粉病的感病性, 这说明MLO基因的功能在进化过程中具有保守性。因此, 对小麦MLO等位基因的缺失突变有望产生广谱抗白粉病的品种。

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组和中国科学院微生物研究所邱金龙课题组合作, 利用基因组编辑技术首次在六倍体小麦中对MLO基因的3个拷贝同时进行了突变, 获得了对白粉病具有广谱抗性的小麦材料。该研究首先利用TALEN技术实现了多个拷贝基因的同时突变,即根据小麦MLO基因3个拷贝的保守区设计一对TALENs,发现TALEN诱导的突变可以稳定遗传到后代, 并符合孟德尔遗传规律。突变体材料经过一代或两代自交, 获得了MLO基因不同组合的纯合突变体(tamlo-aa,tamlo-bb,tamlo-dd,tamlo-aabb,tamlo-aadd,tamlo-bbdd,tamlo-aabbdd)。通过小麦白粉菌接种实验, 发现只有小麦A、B和D基因组上3个MLO基因拷贝同时突变的纯合突变体tamlo-aabbdd表现出对白粉菌极为显著的广谱抗性, 而其他组合的纯合突变体与野生型一样对白粉病具有感病性(图 1)。该结果表明小麦MLO基因的 3个拷贝在功能上存在冗余, 这也可能是到目前为止在自然条件下或利用传统育种手段而没有获得小麦mlo抗病材料的主要原因。

图1 TaMLO基因3个拷贝的纯合突变体使小麦对白粉病表现出极为显著的抗性

该研究还利用CRISPR/Cas9系统实现了对小麦MLO基因的定向突变, 即针对MLO基因的单个拷贝设计CRISPR/Cas9靶位点, 原生质体和转基因植物中的结果表明突变只发生在A基因组上。这个结果表明, 在多倍体的小麦中, 利用基因编辑技术既可以同时突变多个拷贝,也可以特异地突变单个基因拷贝。此外, 该研究还利用基因组编辑系统引发的DNA自身修复途径非同源末端连接(NHEJ)在小麦MLO位点实现了基因的定点插入, 插入的片段可以稳定遗传。

该研究首次在一个多倍体物种中证明可以对多个部分同源的基因同时并准确地进行编辑, 并展示了通过基因组编辑可以实现不同物种的育种信息资源共享。此外,创制的小麦mlo突变体具有持久、广谱抗白粉病的优点,也将为小麦白粉病的抗病育种提供重要的起始材料。该工作为小麦基因功能的研究以及育种新材料或品种的创制提供了一个全新的思路和技术路线。研究结果于2014年7月20日在线发表在生物技术领域权威期刊《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上(http://dx.doi.org/10.1038/nbt.2969)。Nature Biotechnology同期配发一篇“News and Views”, 对该研究及相关领域的进展进行全面评述。