以尿钙排泄量为效应指标评价枸橼酸氢钾钠颗粒人体生物等效性

张 华，刘 沙，李 荣，王本杰，郭瑞臣

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东万杰医学院药学教研室，山东淄博255213；3.山东大学齐鲁医院临床药理研究所，山东济南250012）

以尿钙排泄量为效应指标评价枸橼酸氢钾钠颗粒人体生物等效性

张 华1，2，3，刘 沙3，李 荣3，王本杰3，郭瑞臣3

（1.山东大学药学院，山东济南250012；2.山东万杰医学院药学教研室，山东淄博255213；3.山东大学齐鲁医院临床药理研究所，山东济南250012）

目的以24 h尿液钙离子累计排泄量为指标，比较国产和进口枸橼酸氢钾钠颗粒剂的生物等效性。方法36名男性健康志愿者按自身交叉设计，随机口服枸橼酸氢钾钠颗粒剂的受试制剂（国产）或参比制剂（进口）5.0 g，（洗脱期7 d）。分别收集给药前（空白）和给药后0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h的尿液，记录尿量，采用原子吸收分光光度法测定尿液钙离子浓度，计算给药前、后24 h尿液钙累积排泄量。结果受试制剂给药前、后24 h尿钙累积排泄量为（128.47±76.45）mg和（163.53±81.28）mg；参比制剂给药前、后24 h尿钙累积排泄量为（128.34±59.55）mg和（179.65±103.96）mg。给予受试制剂和参比制剂后24 h尿钙排泄量分别比用药前增加（35.06±61.26）mg和（51.31±73.18）mg，两制剂间没有显著性差异（P＞0.05）。结论国产和进口枸橼酸氢钾钠颗粒剂具有生物等效性，尿液钙离子累计排泄量可用于国产和进口枸橼酸氢钾钠颗粒剂生物等效性评价。

枸橼酸氢钾钠颗粒；参比制剂；受试制剂；钙；生物等效性；原子吸收分光光度法

泌尿系统结石是影响人类健康的一种严重疾病，低枸橼酸症和高钙是引起结石的主要原因，口服枸橼酸氢钾钠可降低尿液钙离子浓度，增加尿液pH值和枸橼酸根浓度［1］。通过增加尿酸和胱氨酸结石的可溶性，溶解尿酸结石，防止新的结石的形成［2］。临床主要用于胱氨酸结石和胱氨酸尿的维持治疗。本试验采用简便、灵敏的火焰原子吸收分光光度计法测定尿液钙浓度［3］，以尿钙累积排泄量为指标，评价国产枸橼酸氢钾钠颗粒剂（受试制剂）与进口枸橼酸氢钾钠颗粒剂（参比制剂）的生物等效性［4］，为其新药注册和临床应用提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂和仪器 枸橼酸氢钾钠颗粒受试制剂［A，规格：2.43 g／2.5 g（以K6Na6H3（C6H5O7）5计），2.5 g／袋，批号：1007901，山东京卫制药有限公司］；枸橼酸氢钾钠颗粒参比制剂［R，规格：97.1 g／100 g，100 g／听，批号：0918638，德国马博士大药厂生产（商品名友来特）］。娃哈哈饮用纯净水（批号：20110713，杭州娃哈哈集团有限公司生产）；钙标准溶液（1 000μg·mL－1，批号：GSB07－1263－2000，国家标准物质研究中心）；硝酸（优级纯65%～68%，批号：20060807，上海试剂四厂）；氧化镧（高纯试剂，批号：F200090219，国药集团化学试剂有限公司）。Solaar M－6原子吸收分光光度计（英国Thermo Elemental公司，）；WM－2H型无油气体压缩机（天津市医疗器械二厂）；Sartorius BS224S电子天平（量程220 g，精度0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 受试者选择 健康男性志愿者36名，年龄（24.9±1.06）岁，体重（67.1±6.12）kg，统一进行查体及实验室检查。所有志愿者无心、肝、肾、消化道、精神神经系统异常，非过敏性体质，无药物过敏史，试验前2周内无用药史，3个月内未用过已知对某脏器有损害的药物，所有受试者自愿参加试验并签署知情同意书。

1.3 试验设计 根据枸橼酸氢钾钠颗粒临床试验批件要求和国家新药审评中心《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究的技术指导原则》，设计枸橼酸氢钾钠颗粒人体生物等效性研究方案，试验方案经山东大学齐鲁医院国家药品临床研究机构伦理委员会批准。试验于山东大学齐鲁医院国家药品临床研究机构Ⅰ期临床试验病房内进行，具有相应娱乐设施和休息场所。试验过程有相应的医疗保护和抢救措施，主要研究者具备相应研究资质和丰富经验，可充分保证受试者安全和试验的顺利进行。

采用单剂口服双周期、双交叉试验设计。36名受试者按体重分层后随机分为两组，每组18人。试验期间统一进食标准餐，饮用纯净水，禁食补钙制剂及对胃肠强刺激性食物，保证每日提供钙9.35 mmol，使钙的摄入和排出趋于稳定。受试者试验前二日入住Ⅰ期病房，试验前一日采集受试者给药前（空白期）尿液，试验日晨7∶00，单次口服受试制剂或参比制剂5.0 g，250 mL温开水溶解送服，收集给药后尿液。

试验前后尿液分段采集，分别为0～2、2～4、4～6、6～8、8～10，10～12、12～24 h，记录尿液体积，留取10 mL，分双份－20℃冷冻待测。清洗期为7 d，于第8天两组志愿者交叉服药，进行第二周期试验。

1.4 尿液钙离子浓度测定 采用原子吸收分光光度计测定尿液中钙离子的浓度。仪器参数灯电流：4 mA，检测波长：422.7 nm，光谱通带宽度：0.5 nm，火焰类型为Air－C2H2，燃气流量：1.4 L·min－1，燃烧器高度：11.0 mm。

尿样室温中融化，取1mL加入5mL比色管中，加入1 mL硝酸，混匀，放置5 min，水定容至刻度。混匀后取1mL溶液，置于5 mL容量瓶中，用氧化镧溶液定容至刻度，混匀，上机测定。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线建立 分别精密量取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL钙标准溶液，置100 mL容量瓶中，加20 mg·mL－1氧化镧溶液至刻度，摇匀。配制成浓度为0.5、1、2、4、6、8、10μg·mL－1钙标准溶液，进样测定相应吸光度，每个浓度测5次。以钙浓度作为X，相对应的吸光度值作为Y，进行线性回归，得回归方程Y＝0.025 0＋0.040 01X（r＝0.999 8，线性范围为0.5～10μg·mL－1），最低定量限为0.5μg·mL－1。

2.1.2 精密度和回收率 分别精密量取0.05、0.5、0.9 mL钙标准溶液，置于100 mL容量瓶中，加20μg·mL－1氧化镧溶液到刻度，摇匀。每个浓度于1 d内测定25次，考察批内精密度。每个浓度连续测定3 d，每天测定25次，考察批间精密度；根据测定浓度计算尿钙相对回收率。方法精密度良好，批内、批间精密度均＜5%；回收率均101%～105%，可满足尿钙测定要求。

2.1.3 稳定性 取低、中、高（0.5、5、9μg·mL－1）浓度的质控样品，分别测定室温放置7 d、14 d、－20℃存放15 d、－20℃存放24 h冻融2次的稳定性。结果表明，钙标准溶液室温7 d、14 d，－20℃存放15 d及－20℃存放24 h冻融2次均稳定，相对标准偏差（RSD%）在0.4%～3.7%内。

2.2 24 h尿量、尿钙浓度和尿钙排泄量 5.0 g枸橼酸氢钾钠颗粒试验制剂和参比制剂给药前、后24 h各时间段尿量、尿钙浓度及尿钙排泄量，见表1、2。

表1 给受试制剂前后尿量、尿钙浓度（n＝36，±s）

表1 给受试制剂前后尿量、尿钙浓度（n＝36，±s）

时间（h）用药前 用药后尿量（mL）钙浓度（g·mL－1）尿量（mL）钙浓度（g·mL－1）4 49.81±63.16 2～4 263.89±147.6 67.97±71.32 337.42±210.80 52.63±46.83 4～6 229.47±140.34 84.89±49.07 399.33±218.66 80.43±41.84 6～8 337.61±178.57 43.42±32.35 390.39±194.05 55.34±34.46 8～10 370.22±212.37 48.10±36.70 524.06±254.21 42.97±25.34 10～12 291.33±166.55 49.88±38.48 418.22±215.24 56.92±42.42 12～24 487.25±253.76110.55±71.77 673.58±38 0～2 216.64±125.28 63.37±56.16 340.33±215.5 5.90 59.34±35.22

表2 给参比制剂前后尿量、尿钙浓度（n＝36，±s）

表2 给参比制剂前后尿量、尿钙浓度（n＝36，±s）

时间（h）用药前 用药后尿量（mL）钙浓度（g·mL－1）尿量（mL）钙浓度（g·mL－1）0 45.82±28.30 2～4 217.28±143.83 82.11±80.46 368.22±175.73 61.31±50.53 4～6 240.61±185.28 87.95±64.78 352.86±187.06 76.10±46.18 6～8 257.44±156.49 77.54±75.46 387.78±215.61 59.22±39.05 8～10 356.75±202.75 49.30±64.62 440.53±198.45 56.60±48.23 10～12 334.83±181.71 47.48±39.62 414.47±194.72 66.14±45.87 12～24 583.44±318.00 90.02±56.08 609.81±323 0～2 216.53±128.98 66.64±40.75 332.72±190.7.67 81.98±52.78

2.3 不同周期24 h尿钙累积排泄量 见表3。

表3 参比制剂（R）和受试制剂（A）不同周期24 h尿钙累积排泄量（mg）

2.4 受试和参比制剂生物等效性的评价 36名志愿者口服受试和参比枸橼酸氢钾钠颗粒剂前、后24 h尿钙累积排泄量见表4。可见用枸橼酸氢钾钠颗粒剂的参比制剂后24 h尿钙累积排泄量比用药前明显增加，差别有显著意义（P＜0.01）；用枸橼酸氢钾钠颗粒剂的受试制剂后24 h尿钙累积排泄量也比用药前明显增加，差别有显著意义（P＜0.05）。但由受试制剂引起尿钙排泄的增加量与参比制剂比较，没有显著性差异（P＞0.05）。36名健康志愿者分别服试验制剂和受试制剂后，各时间区间尿量、尿钙排泄量均值与用药前相比，部分不同程度增加，没有显著性差异（P＞0.05），结果见表5、6。综上，说明枸橼酸氢钾钠颗粒剂的受试制剂和受试制剂具有生物等效应。

表4 口服受试和参比枸橼酸氢钾钠颗粒剂前、后24 h尿钙累积排泄量（mg，n＝36，±s）

表4 口服受试和参比枸橼酸氢钾钠颗粒剂前、后24 h尿钙累积排泄量（mg，n＝36，±s）

用药前参比制剂 128.34±59.55 179.65±103.96*药物 用药前 用药后 用药后－51.31±73.18受试制剂 128.47±76.45 163.53±81.28**35.06±61.26

注：*P＜0.01，**P＜0.05，与用药前比较

表5 参比制剂（R）和受试制剂（A）不同时间区间尿钙差值（mg）

表6 参比制剂（R）和受试制剂（A）不同时间区间尿量差值（mL）

3 讨论

枸橼酸氢钾钠口服可降低尿液钙离子浓度，增加尿液pH值和枸橼酸根浓度。低钙离子浓度可降低尿液中能形成结石的钙盐饱和度，降低尿液中形成钙盐结石的可能性；高pH值能增加尿酸和胱氨酸结石的可溶性，溶解尿酸结石，防止新的结石的形成。

某些内源性物质如钾离子由于机体存在自稳机制，在一定范围内血浓度相对恒定，难以获得理想的血药浓度－时间数据［5］。本试验以给药前后24 h钙排泄量增加值为指标，评价枸橼酸氢钾钠口服制剂的生物等效性。

钙离子为体液中固有的电解质成分，属内源性物质，血钙水平受饮食等生理因素的影响。因此，采用平衡饮食、给药前后对比的方法，计算给药前后24 h钙排泄量增加值。尿药累积排泄法非创伤性取样，易为受试者接受，尿液量大，成分简单，干扰成分少［6，7］。但可变因素多，如易受饮水量、尿量收集的完整性影响。

本试验参照FDA文件设立一定时间的饮食平衡期和基线期，受试者在整个两周期的试验中都严格的定时定量接受标准饮食和纯净水，测定尿钙离子基线水平。口服枸橼酸氢钾钠制剂后，检测尿钙浓度，其变化可以反映枸橼酸氢钾钠降低尿液钙离子的作用［8］。

枸橼酸氢钾钠为尿石症常用治疗药物，口服可降低尿液钙离子浓度，增加尿液pH值和枸橼酸根浓度。本试验结果显示，健康志愿者空腹口服枸橼酸氢钾钠颗粒剂的受试制剂与参比制剂后，尿液钙离子浓度均降低，24 h尿液钙累积排泄量与用药前相比，有不同程度增加，但2种制剂引起的增量无显著性差异（P＞0.05），符合生物等效性的统计学要求以及两制剂生物等效的假设，枸橼酸氢钾钠受试制剂与参比制剂生物等效。

［1］朱磊，王雷.枸橼酸氢钾钠颗粒对上尿路结石体外冲击波碎石后复发率的影响［J］.实用医院临床杂志，2008，5（5）：91－92.

［2］吴国荣，陈国千，周德琪.尿结石患者尿钙、磷、镁、尿酸检测的临床意义［J］.实用医学杂志，2010，26（21）：4044.

［3］菅凌燕，何晓静，肇丽梅，等.复方氨基酸鳌和钙的人体吸收及其生物等效性［J］.中国医院药学杂志，2009，29（12）：983－986.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录.

［5］许羚，赵佳，等.内源性药物尿药生物等效性的试验设计和分析方法［J］.中国临床药理学杂志，2011，27（10）：793－796.

［6］曹国颖，朱孔彩，胡欣.内源性物质药物生物等效性评价的探讨［J］.中国新药杂志，2012，21（13）：1558－1561.

［7］高其若，郑军华，丁强，等.112例输尿管结石患者尿枸橼酸和尿钙含量的测定［J］.第二军医大学学报，2007；28（10）：1136－1137.

［8］王水强，赵建中.生物等效性研究的一般原则与特殊问题［J］.中国临床药理学杂志，2010，26（1）：3－6.

Evaluation of the bioequivalence of domestic and im ported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granulesw ith accumulative urinary excretion of calcium as index in healthy volunteers

ZHANG Hua1，2，3，LIU Sha3，LIRong3，WANG Ben-jie3，GUO Rui-chen3
（1.School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Pharmacy，Shandong Wanjie Medical College，Zibo 255213，China；3.Institute of Clinical Pharmacology，Qilu Hospital，Shandong University，Jinan 250012，China）

ObjectiveTo evaluate the bioequivalence of imported and domestic Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules with accumulative urinary excretion of calcium as index in Chinese healthy volunteers.MethodsThirty－six healthymale volunteers were randomLy administered with a oral single dose of5.0 g domestic（test）and imported（reference）Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules in a crossover study with a washout period of7 days.Urinewas collected before or after oral doses at the scheduled time（0～2，2～4，4～6，6～8，8～10，10～12，12～24 h）.Urine volumes were recorded，urinary calcium concentration was determined by atomic absorption spectrophotometric and twenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were calculated.ResultsTwenty－four hours of accumulative urinary excretion of calcium were（128.47±76.45）mg and（163.53±81.28）mg before and after taking test preparation；（128.34 ±59.55）mg and（179.65±103.96）mg before and after taking reference preparation，respectively.Increase in 24 h urinary excretion of calcium after taking test and reference preparation were（35.06±61.26）mg and（51.31±73.18）mg，respectively.There was no significant difference（P＞0.05）in increase of24 h accumulative urinary excretion of calcium between the two preparations.ConclusionThe domestic and imported Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granuleswere bioequivalent.

Potassium Sodium Hydrogen Citrate Granules；Reference preparation；Test preparation；Calcium；Bioequivalence；Atomic absorption spectrophotometry

R944

A

2095－5375（2014）09－0501－004

张华，女，讲师，研究方向：药物分析，E－mail：zhanghua0216＠126.com

郭瑞臣，教授，博士研究生导师，研究方向：临床药理学，Tel：0531－82169636，E－mail：grc7636＠126.com