胰岛素对糖尿病大鼠线粒体合成机制的研究进展

李永光，朱 伟，陆志刚，高美芳(综述)，魏 盟(审校)

(上海交通大学附属第六人民医院心血管内科，上海 200233)

糖尿病对人们社会生活以及经济产生重要影响，糖尿病在近年来引起越来越多的关注[1]。糖尿病的发病机制中胰岛素是最重要的调节因子，也是体内糖脂代谢的重要调节因子。在对胰岛素机制研究的过程中，越来越多的研究者将目光聚焦在线粒体。线粒体是重要的细胞器，在线粒体中发生很多重要的生化反应。最近的研究显示，胰岛素可以调控线粒体蛋白合成并作用于线粒体功能，因此研究胰岛素和线粒体的关系以及相关信号通路有重要的实际意义。

1 胰岛素信号通路

1.1胰岛素调控营养和能量平衡信号通路 胰岛素可以调控营养和能量平衡，其通过胰岛素受体信号(insulin receptor signaling，IRS)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB又称AKT)信号通路作用于雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，除此之外，胰岛素还可以作用于重组人血红素加氧酶1(human heme oxygenase 1，HMOX1)，控制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态)(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)+/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)比率，进而调控线粒体电子传递链的完整性以及活性。受其调控的NAD+/NADH比率可以调节sirt1/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α)信号通路，从而调控线粒体合成以及功能。作为胰岛素信号下游通路中的重要因子，AKT可以使叉头转录因子蛋白O1(forkhead box protein O1，FOXO1)、FOXO3和FOXO4磷酸化，FOXO转录因子调控了上百种基因的表达，其中包括一些参与糖脂代谢以及应激抵抗的基因[2]。

1.2胰岛素调控蛋白合成以及细胞生长信号通路 胰岛素还可以促进蛋白合成并激活细胞生长相关的信号通路。胰岛素调控蛋白合成包括磷酸化/去磷酸化一些转录因子和核糖体蛋白。在转录因子中，PKB/AKT是最重要的复合物，PKB/AKT可以调控两个底物。糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)和forkhead转录因子FOXO家族，两者分别调控蛋白转录。GSK3参与调控蛋白转录，GSK3使elf-2B磷酸化并失活[3]，通过抑制GSK-3活性，胰岛素激活elf-2B，从而促进蛋白合成。尽管胰岛素、PKB、GSK3以及elf-2B在许多组织中已经得到证明，然而相似的研究尚需要在心肌组织中进行。相对应的是，GSK3参与负性调控心肌肥大核转录因子活性，从而抑制心肌肥大基因表达[3]。PKB/AKT可以磷酸化从而使G蛋白Rheb的GTP酶激活蛋白、结节性硬化症蛋白2(tuberous sclerosis factor 2，TSC2)失去活性，TSC2激活可以促进Rheb与GDP无效结合。通过TSC2、PKB/AKT引起Rheb活性变化，可以导致mTOR磷酸化和活化，但此机制尚未明确[3]。胰岛素在心肌细胞中调控PKB/AKT/TSC2/mTOR信号通路。该通路主要调控两个靶点4E结合蛋白1(4E-binding protein 1，4E-BP1)以及p70核糖体S6蛋白激酶(p70 ribosomal S6 kinase，p70S6K)，从而调控蛋白转录，mTOR参与4E-BP1磷酸化，从而使其对elf-4E的抑制作用降低，允许该因子和mRNA cap结合，促进蛋白合成。激活的p70S6K使S6核糖体蛋白磷酸化，包括调控5′TOP mRNAs转录，5′TOP mRNAs编码部分转录因子和核糖体蛋白。因此，S6磷酸化促进核糖体合成、转录因子水平增高及活性增加。Eef2(eukaryotic elongation factor 2)激酶是p70S6K的另一个底物。Eef2激酶是一个明确的钙以及钙调蛋白依赖激酶，控制Eef2的磷酸化和失活。大量的研究证明，在心肌细胞中，胰岛素参与调节4E-BP1、p70S6K/S6和eEF2激酶/eEF2[3]。Atrophy以及和它相关的蛋白酶，可以认为和蛋白合成作用相反。FOXO家族成员包括FOXO1、FOXO3a和FOXO4，最初认为促进骨骼肌相关基因转录活化[4]。更甚，受PKB/AKT调控的FOXO磷酸化促进了它们的胞核转录，从而抑制atrophy。与骨骼肌发生情况类似，胰岛素通过PKB/AKT信号通路抑制FOXO3a，从而抑制心肌细胞atrophy。最近研究表明，FOXO1也参与类似调节[5]。

1.3胰岛素参与调控糖脂代谢信号通路 在IRS1和IRS2双剔除小鼠中，一些调控糖脂代谢的基因明显下调，导致葡萄糖耐受降低和脂代谢失调[6]。当在肝脏中剔除IRS1和IRS2，肥胖可引起胰岛素抵抗以及FOXO1激活，引起下游血红素加氧酶1激活，HMOX1可以消耗亚铁血红素，从而破坏线粒体电子传递链紧密性，进而影响线粒体功能；肝脏胰岛素抵抗激活FOXO1，导致上百种基因(包括HMOX1)表达，HMOX1酶降解heme，这些导致线粒体电子传递链功能障碍，因为后者是潜在的促电子传递，保证电子传递链组成稳定以及功能完整性的结合因子。随之，NADH氧化水平障碍以及NAD+/NADH比率降低，导致线粒体sirt1/PGC-1α通路障碍[7]。NAD+是酰基辅酶A脱氢酶潜在的辅助因子，伴随着NAD+浓度降低，电子传递链的功能缺陷可以使脂肪酸氧化；当剔除FOXO1或HMOX1可以重新上调线粒体合成相关的sirt1/PCG-1α信号通路，重新挽救线粒体功能(电子传递链活性、NAD+/NADH比率以及脂肪酸氧化率)，同时也使肝脏三酰甘油正常化[2]。而在胰岛素抵抗或缺乏的肝脏和骨骼肌中，AKT/FOXO1级联信号抑制了PGC-1α表达[8]。

胰岛素信号通路作用于糖代谢和蛋白合成，此信号通路可以受环腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)调控[3]。AMPK可以促进心肌细胞糖的摄入以及糖酵解，可能是通过葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT4)易位以及磷酸果糖激酶2活化而达到[3]。更甚，AMPK可以促进长链脂肪酸吸收。但是，在最近的研究中显示，AMPK通过抑制TSC2/mTOR/p70S6K[9]和Eef2信号通路，拮抗胰岛素对蛋白合成的促进作用[10]。AMPK激活拮抗PKB/AKT参与的p70S6K激活、Eef2磷酸化以及心肌细胞蛋白合成。尽管如此，AMPK在调控蛋白合成中的作用仍然需要进一步证明。

上调过氧化物酶增殖体激活受体α(peroxisome proliferation activated receptor-α,PPAR-α)拮抗胰岛素活性，降低葡萄糖进入细胞的量，并抑制糖酵解以及线粒体丙酮酸氧化[11]。在啮齿类动物模型中，当心脏剔除PPAR-α，降低部分参与脂肪酸代谢的基因表达水平，使底物选择性得到葡萄糖[11]。PPAR-α或PGC-1α过表达，脂肪酸吸收以及氧化升高，得到和糖尿病心肌肥大类似的表型。研究发现，PPAR-α在晚期糖尿病中下调，当胰岛素活性受到PPAR-α抑制，糖酵解和丙酮酸氧化率在缺氧时下降最明显[11]。而糖代谢在心肌当中比骨骼肌和其他组织至少高4倍，可能原因是GLUT4在心肌中高表达。胰岛素通过和细胞膜表面的胰岛素受体结合，促进心肌细胞糖吸收，并激活胞内信号通路。其中包括胰岛素受体磷酸化、胰岛素受体底物IRS酪氨酸磷酸化以及PI3K、磷脂酰肌醇蛋白依赖性激酶1、AKT/PKB以及蛋白激酶C的激活。激活的胰岛素信号通路使GLUT4从胞内转位到胞膜，从而促进糖转移进细胞；在心肌细胞中胰岛素同样可以使GLUT1从胞内转位到胞膜，但是作用较GLUT4小[12]。哺乳动物mTOR是调控蛋白合成、糖脂代谢以及细胞生长重要的调节因子[12]，是一丝氨酸-苏氨酸激酶，胰岛素激活mTORc1，进而引起核糖体S6K1和真核翻译起始因子4E-BP1磷酸化，从而导致mRNA转录以及蛋白合成；在心肌中，mTOR还受到锻炼调控，高强度的跑步训练，可以激活AKT信号通路，引起mTOR活性增高，从而促进小鼠心肌生理性肥厚[12]。

1.4胰岛素参与调控线粒体电子传递链信号通路 胰岛素可以调控线粒体电子传递链，例如细胞色素C(电子传递链中的关键组件，可能参与调控电子传递链的速率)。另外，在培养的大鼠腰椎背根神经节神经中，胰岛素可以激活环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)，在被CREB调控的基因中，1/3和糖代谢相关[2]。胰岛素参与保护高血糖引起的线粒体氧化磷酸化抑制，可能是由于胰岛素编码氧化呼吸链复合物mRNA。胰岛素在链脲霉素处理的动物肾脏中，可以调节细胞氧化磷酸化活性。有报道显示，胰岛素保护作用是通过激活PI3K/AKT来起作用，且AKT信号通路是一促生存信号通路[2]。此外，Remor等[13]证明，胰岛素可以下调第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)基因以及PTEN磷酸化水平。其中PTEN是一磷酸酶，它可以使PI3K产生的第二信使去磷酸化，从而抑制AKT下游信号。另一方面，活性氧类上调、线粒体功能障碍或者持续性高血糖可以上调PTEN[13]，从而诱导细胞能量代谢变化。胰岛素抵抗肝脏中，胰岛素也可以调控氧化磷酸化相关基因表达，从而维护电子传递链完整及其活性。胰岛素通过抑制FOXO1/HMOX1以及控制NAD+/NADH比率，进而调控线粒体合成相关的sirt1/PGC-1α信号通路[2]。

2 线粒体蛋白合成

2.1线粒体蛋白改变 在对1型糖尿病啮齿类动物肝脏和肾脏基因表达谱的研究中发现，基因表达和糖尿病之间存在明显的相关关系[14]。微阵列分析发现链脲霉素诱导的糖尿病大鼠心肌组织，编码线粒体蛋白的1614个调节基因中约13%发生变化。值得注意的是，编码脂肪酸氧化蛋白基因表达增加[14]。采用双向凝胶电泳发现在1型糖尿病OVE26小鼠中，发生变化的蛋白有12个来源于线粒体。而在Bugger等[14]心肌线粒体研究中，鉴别出30个线粒体蛋白发生变化。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠模型中，线粒体脂肪酸氧化蛋白增加，而一些氧化磷酸化蛋白亚基减少。尽管如此，限于凝胶为基础的比较蛋白质组学研究方法的局限性，许多线粒体蛋白质仍未被发现。Bugger等[14]采用半定量液相色谱/质谱法调查1型糖尿病BB-DP大鼠肝脏和心肌组织全细胞蛋白表达谱变化，发现在糖尿病动物中，受调控的365个蛋白，部分是线粒体来源。在Akita小鼠中，除大脑外，线粒体FAO蛋白表达水平并不平行于FAO基因表达水平[14]。在肝脏中，FAO基因表达增加，而线粒体FAO蛋白水平却减少；在心肌中，FAO基因表达降低，但是FAO蛋白表达水平却上调；在肾脏中，FAO蛋白水平增加，但是FAO基因表达水平并没有发生改变[14]。

糖尿病大鼠腰椎背根神经节检测发现氧化呼吸链活动减少，这与线粒体氧化呼吸链部分蛋白下调一致，这也和糖尿病心肌中线粒体呼吸链以及酶活性降低一致，另外2型糖尿病患者骨骼肌中，线粒体呼吸链功能和柠檬酸合酶活性降低[15]。在另一项研究中，严重肥胖(体质量指数52 kg/m2)与编码氧化磷酸化的25个基因中的7个蛋白表达降低相一致[15]。这些基因的表达与肝脏脂质积累呈负相关，同时观察到PGC-1α表达减少以及受甲状腺激素调控的基因表达下调。这与2型糖尿病肥胖者中观察到的变化相一致，同时在小鼠高脂饮食后也伴随着氧化呼吸链基因表达下调[15]。

2.2胰岛素调控的线粒体蛋白 比较蛋白质组学分析表明，线粒体蛋白质组在1型糖尿病心肌中重构[16]。Bugger等[16]报道，在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠线粒体中，参与线粒体脂肪酸氧化的几种蛋白丰度增加，而部分氧化磷酸化亚基选择性下调。线粒体脂肪酸氧化蛋白水平在Akita小鼠心肌中也增高。线粒体蛋白质组表达谱分析发现，在野生型和1型糖尿病小鼠心肌中，针对123个线粒体蛋白的检测报告指出，23%的蛋白在不同群体之间有显著不同[16]。另外，糖尿病心肌线粒体几个氧化磷酸化亚基以及三羧酸循环酶也下调，这和调控线粒体合成的基因PGC-1α、PGC-1β、氧化磷酸化基因表达减少有关。因此，心脏脂肪酸氧化率增加，线粒体呼吸功能降低，可以基于脂肪酸氧化蛋白水平的增加以及糖尿病线粒体氧化磷酸化亚基丰度的降低。在Akita小鼠心脏中，线粒体氧化磷酸化亚基减少可能与PGC-1信号通路转录活性降低有关，虽然不能排除其他机制，如增加蛋白折叠以及降低线粒体蛋白进入线粒体等可能。同时在2型糖尿病模型中，线粒体蛋白质组的变化仍然需要进行深入研究。

胰岛素在肝、肌肉、脂肪组织中可以调节糖代谢以及相关蛋白转录翻译，胰岛素可以直接调控一组与糖异生和糖酵解活动相关的代谢酶。胰岛素可以增加糖酵解酶葡萄糖激酶，丙酮酸激酶和乙酰辅酶A羧化酶转录，同时胰岛素可以调节己糖激酶、细胞色素C以及葡萄糖代谢相关蛋白[17]。研究发现，2型糖尿病患者骨骼肌和同龄人相比，线粒体含量较少[2]。相对应的是，胰岛素可以促进线粒体蛋白合成并提高线粒体氧化能力[2]，但是持久的胰岛素并不能促进糖尿病患者骨骼肌中编码线粒体的关键转录因子mRNA表达[2]。

3 胰岛素的线粒体功能调控

心脏是一个耗能器官，需要恒定的燃料和氧气供应，以维持胞内ATP水平，这是不间断的心肌收缩/舒张必不可少的。为了维持心肌正常生理活动，人的心脏每日生产3.5～5 kg ATP[3]。生理条件下，ATP的产生来自线粒体氧化底物，其中长链脂肪酸60%～70%，葡萄糖20%，乳酸10%。该优选长链脂肪酸是由于长链脂肪酸氧化通过兰德尔周期抑制葡萄糖的摄取和代谢，在可控情况下，酮体循环水平较低，然在饥饿情况下上调，当血液中存在较高水平长链脂肪酸(如慢性心脏衰竭或糖尿病时)控制效果不佳[3]。当葡萄糖和胰岛素水平上升，葡萄糖成为心脏更容易氧化的底物，参与信号转导的胰岛素诱导底物利用机制是复杂的，研究发现胰岛素可以作用于胞内一些靶点，这其中包括葡萄糖转运因子GLUT4、长链脂肪酸转运因子/CD36和糖酵解酶6-磷酸果糖激酶[3]。

由于长期暴露于高血糖，之前研究认为心肌胰岛素抵抗发生于2型糖尿病，目前已知胰岛素抵抗往往预示着高血糖[11]，其也发生在1型糖尿病中[11]。然而，细胞机制仍然未完全明了。研究证明，胰岛素受体和相关的胰岛素样生长因子1受体信号通过两个基本途径，一个通过促分裂原活化的蛋白激酶，另一个通过PI3K/AKT代谢途径[11]。每种途径都有自己的骨架蛋白受体介导信号。在有丝分裂通路中，支架蛋白Shc和内源性的激活受体结合，通过级联反应最终激活促分裂原活化的蛋白激酶。

在持续高血糖影响下，胰岛素可以防止1型糖尿病大鼠感觉神经元线粒体内膜除极。胰岛素缺乏可诱发糖尿病神经病变感觉神经元中线粒体功能障碍。使用胰岛素治疗，细胞线粒体功能可以得到挽救[17]。细胞线粒体功能受损往往伴随着与年龄相关的胰岛素抵抗，功能受损往往通过降低肌肉葡萄糖摄取、代谢以及线粒体氧化磷酸化活性来达到[2]。在对糖尿病患者骨骼肌的研究中发现，编码氧化磷酸化的酶基因下调、ATP合酶蛋白β-亚单位下调以及线粒体氧化呼吸功能下调，同时研究发现，NADH氧化酶以及NADH氧化酶/ATP柠檬酸裂合酶活性降低，同时研究发现NADH氧化酶/β-羟酰辅酶A脱氢酶比率是在2型糖尿病和肥胖患者中的1/3～1/2倍[18]。然而在2型糖尿病研究中，线粒体相对缺失并不导致胰岛素抵抗，相反上调了胰岛素敏感性[19]，具体机制需要继续研究。

在最近的研究中发现，胰岛素在大鼠大脑中降低线粒体来源活性氧类[20]。在饮食诱导的糖尿病中，促进胰岛素分泌时可以增强线粒体功能，降低脂肪酸氧化[21]。而在Goodpaster[22]的研究中，线粒体缺失和胰岛素抵抗相关，其中线粒体氧化磷酸化和胰岛素抵抗关系最为密切[23]。

4 结 语

胰岛素在糖尿病治疗中起到了非常重要的作用。胰岛素以及其相关信号通路在线粒体蛋白合成以及维系线粒体功能完整中扮演了重要角色。其中PI3K信号通路尤为重要；除此之外，胰岛素信号通路和其他信号通路紧密联系，如AMPK信号通路现在被认为是治疗胰岛素信号通路障碍的途径之一；线粒体功能及代谢障碍在糖尿病进展中起到非常重要的作用。胰岛素及其信号通路和代谢与线粒体氧化呼吸链相关，然而胰岛素在线粒体蛋白合成，功能调控中的作用和机制尚不明确，需要在以后的研究中进一步深入研究。

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