抑菌中药的性能及其在家用洗涤剂中的应用研究

龙致科，黄柳云，周传检，胡永志，王 韧，李秋芳，周 慧

（柳州两面针股份有限公司，广西 柳州 545001）

抑菌中药的性能及其在家用洗涤剂中的应用研究

龙致科，黄柳云，周传检，胡永志，王 韧，李秋芳，周 慧

（柳州两面针股份有限公司，广西 柳州 545001）

测试了黄芩、甘草、苦参、白鲜皮、当归等中药的提取物和含中药成分的洗涤剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。同时，对比了甲基异噻唑啉酮、三氯生和对氯间二甲苯酚等化学防腐/抑菌剂的抑菌效果、刺激性和毒性。结果显示，中药抑菌成分有较好的抑菌效果，刺激性和毒性都很低。

洗涤剂；抑菌；中草药；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌

我国中草药的应用具有系统的理论基础和丰富的临床实践，将中草药应用于抗菌抑菌、治疗病毒类疾病的历史悠久。最新的诸多研究表明，多种中草药的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制效果。同现今广泛使用的抗生素以及化学防腐剂相比，中草药中所含的抗菌物质具有毒副作用小、安全性高等优点。因此，以中草药提取物代替化学防腐/抑菌剂，已成为诸多领域研究的新热点。

以《中国药典》的相关记载为依据，选取黄芩、甘草、苦参、白鲜皮、当归等5种中草药进行抑菌效果研究。通过抑菌圈法和抑菌率法，测试分析中药成分对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌作用，为进一步研究开发中草药抑菌成分在洗涤剂中的应用提供参考依据。

目前，市场上的家用除菌类洗涤剂大都使用甲基异噻唑啉酮、三氯生和对氯间二甲苯酚（PCMX）等化学防腐/抑菌剂来达到除菌效果。然而，由于化学防腐抑菌剂容易存在刺激性和毒副作用较大等不良反应，其在洗涤剂或化妆品中的用量受到相关法规的限制。所以，一般日用除菌产品的除菌效果不是很理想。另外，如果长期使用含化学防腐/抑菌剂的洗涤用品，其刺激性和毒副作用还会威胁人体健康，存在安全隐患。因此，合理运用中药成分来防腐/抑菌，能够有效降低洗涤产品的刺激性和毒副作用，有助于开发出更加安全有效的植物抑菌产品，从而更有利于人们享受健康生活。

1 材料与方法

1.1 材料

供试中药材：黄芩、甘草、苦参、白鲜皮和当归。

供试菌种：大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 6538），菌种均由广东省微生物分析检测中心提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

洁净操作台，立式高压灭菌锅，恒温培养箱，抑菌圈测量仪，微量移液枪等。

1.2.2 试剂

1）硬水：标准硬水，硬度342mg/L（氯化钙0.034g，氯化镁0.139g，蒸馏水加至1L）。

2）磷酸盐缓冲液（PBS），0.03mol/L，pH值7.2～7.4（无水磷酸氢二钠2.83g，磷酸二氢钾1.36g，蒸馏水加至1L）。

3）营养琼脂。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

用75%乙醇溶液，按产出药水∶药材＝1∶1比例提取浓缩，制备中药提取物，控制提取液酒精浓度小于25%。

将按上述方法制备的黄芩、甘草、苦参、白鲜皮和当归提取物等量制成中药混合药水。

1.4 抑菌圈试验

菌液的制备：取菌种第3～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18～24h），用5mL的0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔；使菌悬浮均匀后，用PBS稀释至所需浓度。菌悬液为5×105～5×106cfu/mL。

采用管碟法，用微量移液枪吸取上述菌悬液100μL至已完全凝固的营养琼脂培养基表面，立即用无菌玻璃涂布棒均匀涂布，盖好平皿，置室温干燥5～10min。然后，用无菌镊子将无菌牛津杯立在培养基表面，各牛津杯中心距离25cm以上，与平皿周边距离15cm以上，切勿弄破培养基。最后，用硬水将中药醇提取物分别稀释成1∶1、1∶50、1∶100三个作用浓度，并将其滴加至液面与牛津杯表面平行，将培养皿放置在37℃温箱，培养16h～18h后观察结果。

采用“十字交叉法”测定抑菌圈大小。参照《消毒技术规范》和《中药药理学》的抑菌圈结果判定标准：抑菌圈直径≥20mm为高度敏感，10～19mm为中度敏感，≤10mm为低敏感，0mm为无抑菌效果。

1.5 抑菌率试验

将试验菌18～24h斜面培养物用PBS洗下，制成菌悬液。要求的浓度为：用100μL滴于5mL样液内，回收菌数为1×104～9×104cfu/mL。

取被试样液（按1∶1的比例用硬水稀释被试样液）和对照样液各5mL，分别再向其内滴加100μL菌悬液，均匀混合，开始计时；作用2min后，分别吸取样液0.5mL加入含5mL PBS的试管内，充分混匀；然后，适当进行稀释，取其中2～3个稀释度，分别吸取1mL，置于平皿，用晾凉至40～45℃的营养琼脂培养基（细菌）作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35℃±2℃培养48h，作活菌菌落计数。

试验重复3次，取其平均值，抑菌率＞50%为有抑菌作用，＞90%为有较强抑菌作用。按下式计算抑菌率：

X＝(A-B)÷A×100%

式中，A代表对照样菌数，B代表试验样菌数。

1.6 抑菌稳定性试验

在一定比例的中药混合提取物中加入表面活性剂，制得抑菌洗涤剂。将洗涤剂按1∶1进行稀释，按抑菌率测试方法分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抑菌试验。作用时间2min，测定和计算洗涤剂的平均抑菌率。之后，将它们密封保存在40℃的恒温箱内135天。最后，取出恢复至室温，再进行同样的测试。通过比较封存前后抑菌率的变化，评价其抑菌稳定性。

1.7 刺激性试验

使用孵化到第9天的受精鸡蛋，剪开气室端的蛋壳；在卵壳膜上加几滴蒸馏水，让绒毛囊膜（CAM）与卵壳膜分离，剥去蛋膜露出血管化的CAM，选用不受损的CAM进行试验。

在CAM上滴加0.1mL样品，30s后用0.75%的盐水冲洗CAM至干净。观察和记录5min内血管充血、出血和凝血出现的初始时间，并计算刺激分值。刺激分值越大，则表示样品的刺激性越大。

刺激分值的计算公式为：

IS＝[(301-A)×5+(301-B)×7 +(301-C)×9]÷300

式中：A—充血初始时间（s）；B—出血初始时间（s）；C—凝血初始时间（s）。

1.8 毒理试验

选用20只昆明小鼠进行毒理试验，雌、雄各半。采用一次最大限度试验法，剂量设定为5000mg/kg体重。试验前，动物禁食16h，不限饮水。按0.4mL/20g体重的量给动物灌喂样品。灌喂后，观察、记录动物的中毒症状和死亡情况，连续观察14天。

2. 结果和分析

2.1 抑菌圈试验结果

2.1.1 中药提取物对大肠杆菌的抑菌效果

黄芩、甘草、苦参、白鲜皮和当归这5种中草药的提取物对大肠杆菌的抑菌效果见表1。

由表1可知，在对大肠杆菌的抑菌圈试验中，测试的中药醇提取物的抑菌效果随着其作用浓度的增大而增强。当作用浓度为1∶100时，仅有当归醇提物出现低敏抑菌作用，其他均无抑菌作用；当作用浓度为1∶50时，有4种中药提取物有抑菌作用，其敏感度由大到小依次为：甘草＞白鲜皮＞苦参＞当归；当作用浓度为1∶1时，5种中药提取物均具有高敏抑菌作用，且抑菌圈直径在25.00～29.00mm。

2.1.2 中药醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

黄芩、甘草、苦参、白鲜皮和当归5种中草药的醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见表2。

由表2可知，这5种中药提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用与药水浓度的关系是：药水浓度越大，抑菌效果越好。在1∶50与1∶100的作用浓度条件下，抑菌效果仅有甘草、苦参、当归3种存在较为明显的区别，两个作用浓度的抑菌圈差值在4.00mm以上，而黄芩、白鲜皮在这两个作用浓度下的抑菌作用区别并不大；当作用浓度为1∶1时，5种中药醇提物均出现明显的抑菌圈，抑菌圈直径在22.00～33.00mm，均为高敏抑菌作用。

2.2 抑菌率试验结果

按1.5的步骤，通过实验测试了各种中草药提取物对试验菌的抑菌率，并与甲基异噻唑啉酮、三氯生和对氯间二甲苯酚（PCMX）等化学防腐/抑菌剂的抑菌率进行了对比，结果见表3。

由表3可以看出：1）与空白样对比，证明酒精含量低于25%的黄芩、甘草、苦参、白鲜皮、当归等中药提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑菌作用。2）0.3%的三氯生溶液抑菌效果最好，对两个试验菌的抑菌率都能达到99.99%。3）黄芩、甘草、苦参、白鲜皮、当归等中药提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用强于甲基异噻唑啉酮；0.5%对氯间二甲苯酚（PCMX）溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到99.85%，稍高于各中药提取物的抑菌率；0.5% PCMX对大肠杆菌的抑菌率则低于中药提取物。

2.3 抑菌稳定性试验结果

含中药混合提取物的洗涤剂样品密封保存于40℃，保存135天后分别以50%和80%的浓度，洗涤剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用2min，测试了含中药提取物的洗涤剂的抑菌稳定性。结果见表4。

表1 中草药提取物对大肠杆菌的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）

表2 中草药提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直径：mm）

表3 中草药提取物对试验菌的抑菌率

表4的结果显示，含50%中药混合提取物的样品对金黄色葡萄球菌的抑菌率＞90%，对大肠杆菌的抑菌率＞50%；含80%中药混合提取物的样品对金黄色葡萄球菌的抑菌率＞90%，对大肠杆菌的抑菌率＞80%。与存放前相比几乎都没有变化。这表明，含中药提取物洗涤剂的抑菌稳定性良好。

2.4 刺激性实验结果

按1.7的方法，通过实验测试了各种中草药提取物的刺激性，并与甲基异噻唑啉酮、三氯生和PCMX等化学防腐/抑菌剂进行了对比，结果见表5。

表5的数据显示：1）不同浓度（原液、1%和0.01%）的黄芩、甘草、苦参、白鲜皮、当归等中药提取物，在5min内血管未出现充血和出血现象，刺激分值为最低值0.07，属于无刺激。2）0.01%和1%的三氯生溶液和对氯间二甲苯酚（PCMX）溶液刺激分值为0.07，属于无刺激。3）0.01%甲基异噻唑啉酮溶液的刺激分值为0.57，属于微刺激；而1%甲基异噻唑啉酮溶液的刺激分值为21.07，有较大刺激性。

2.5 毒性试验结果

按1.8的方法，通过实验测试了各种中草药提取物的毒性，并与甲基异噻唑啉酮、三氯生和PCMX等化学防腐/抑菌剂进行了对比，结果见表6。

表6结果表明，各中药提取物的LD50都大于5000，均属于实际无毒级；而0.01%甲基异噻唑啉酮、0.3%三氯生和0.5%对氯间二甲苯酚（PCMX）均属于低毒。

3. 结论与探讨

由于大多数化学防腐抑菌剂都具有一定的腐蚀刺激性和毒性，所以相关法规对这些成分在日用产品中使用有限量要求。例如，甲基异噻唑啉酮、三氯生和对氯间二甲苯酚（PCMX）等防腐抑菌剂在《化妆品卫生规范》中规定使用的上限值分别为0.01%、0.3%和0.5%。

表4 含中药提取物洗涤剂的抑菌稳定性试验结果

表5 中药提取物和化学除菌剂的刺激性对比

表6 毒性试验数据

通过实验对比，采用黄芩、甘草、苦参、白鲜皮和当归等中药抑菌成分，可以实现与使用化学防腐/抑菌剂（不超过规定使用剂量）同样的抑菌效果，甚至效果会更好。这些中药抑菌成分具有较强的抑菌效果，而且无毒、无刺激，因而适合替代化学防腐抑菌剂，用于开发家用除菌洗护产品，更有益于人体健康。同时，中药作为抑菌成分的应用，也顺应了日化产品追求“无添加、更安全”的发展趋势，将会受到越来越多的关注。

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