基于整合证据链的白鲜皮粉末致肝损伤病例实验研究

黄奕雪+郭玉明+周永峰+章从恩+景静+刘士敬+张娜娜+宋经元+肖小河+王伽伯

[摘要]针对白鲜皮可能导致肝损伤的问题，该文对1例典型的单独服食白鲜皮粉末导致肝损伤病例进行临床和实验室系统研究。按照《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》推荐的整合证据链方法对该病例进行诊断研究。通过临床病史、生化学和影像学等检查，排除基础疾病以及病毒性、自身免疫性、酒精性等易混淆肝病对诊断的影响；通过服药史调查，排除其他药物对诊断的影响，该患者仅服食1种药物，怀疑该患者为“白鲜皮粉末”导致药物性肝损伤。进一步按照《中国药典》对患者服食药物进行质量检查，符合白鲜皮项下规定；采用DNA条形码鉴定，ITS2序列BLAST比对，与植物白鲜Dictamnus dasycarpus相似度为100%；检测外源性有害物质，重金属、农残、微生物毒素均未超过相关标准的规定；采用液相高分辨质谱联用仪及Agilent Fake TCM-Drugs数据库检查，未发现化学药物添加。综上，确定该病例为单独服用白鲜皮粉末（15 g/日，超过药典规定用量）导致药物性肝损伤。该文按照《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》，从临床到实验室系统检查，确认了1例单独服食白鲜皮粉末致药物性肝损伤的典型病例，为后续研究白鲜皮及其相关制剂的肝损伤风险提供了直接和可靠证据。

[关键词]中草药； 肝损伤； 白鲜皮； 整合证据链； 生药学鉴定

[Abstract]A typical clinical case of taking Dictamni Cortex（Baixianpi） powder was analyzed to study liver damage caused by Dictamni Cortex. Liver damage was diagnosed according to the integrated evidence chain method recommended by the Guideline for Diagnosis and Treatment of Herb-Induced Liver Injury. By analyzing clinical history and biochemistry and imaging examinations， underlying diseases， such as viral hepatitis， autoimmune liver disease and alcoholic liver disease， were excluded. Through the investigation of medication history， we made it clear that the patient only took Dictamni Cortex powder during the period， and thus suspected that the liver injury was induced by Dictamni Cortex. Furthermore， the quality of the drug was tested， and the results showed it was consistent with the quality standard of Chinese Pharmacopoeia. DNA barcoding showed that the drug was 100% similar with Dictamnus dasycarpus. Moreover， exogenous harmful substances and chemical drug additions were tested， and the results showed that the content of heavy metal， pesticide residues and microbial toxin were consistent with the required standards， and no chemical drug additions were found in Agilent Fake TCM-Drugs database. In summary， we confirmed that the clinical case of drug-induced liver injury was induced by D. dasycarpus with the dose of 15 g·d^-1， which exceeded the prescribed amount of Chinese Pharmacopoeia. According to the Guideline for Diagnosis and Treatment of Herb-Induced Liver Injury， the case of drug-induced liver injury induced by D. dasycarpus was confirmed， which provided a direct and reliable evidence for the study of risk of liver injury induced by D. dasycarpus and its relevant preparations.

[Key words]Chinese herbal medicine； liver injury； Dictamni Cortex； integrated evidence chain； pharmacognostical identification

白鮮皮为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮，为临床常用清热燥湿、祛风解毒中药，含有白鲜皮的中成药常用于治疗湿热疮毒、湿疹疥癣、湿热黄疸、风湿热痹等。然而，调研发现有较多文献报道含有白鲜皮的中成药或复方制剂导致肝损伤，如复方青黛丸^[1]、消银片^[2]、克银丸^[3]、白癜风胶囊^[4]和痔血胶囊^[5]等。其中，国家药品不良反应监测中心发布了“关注痔血胶囊引起的肝损害”信息通报^[6]，指出痔血胶囊引起肝损伤风险。痔血胶囊由白鲜皮和苦参2味中药组成，其中苦参导致肝损伤的报道很少，而且苦参及其所含生物碱如氧化苦参碱等在临床上还可用于慢性肝炎等疾病的治疗，提示苦参可能不是痔血胶囊导致肝损伤的主要原因。那么，白鲜皮是否是痔血胶囊导致肝损伤的主要原因，值得深入研究。一些临床医生和学者怀疑白鲜皮为上述中成药或复方制剂中导致肝损伤的主要原因，但检索国内外文献数据库，至今还没有单味白鲜皮致药物性肝损伤的研究报道，已有的报道都是与白鲜皮复方制剂有关，影响因素难以排除。白鲜皮致肝损伤还缺少直接和可靠的研究证据。

由于中草药在临床应用的复杂性，中草药肝损伤（herb-induced liver injury，HILI）的临床确诊异常困难。在我国目前临床联合用药方面，中草药经常与化学药联用，而化学药本身有可能存在肝毒性，中药和化学药联用后的相互作用也可能诱发肝毒性，影响HILI的准确诊断^[7]；此外，由于中草药基原混淆、质量不合格及外源性有害物质污染都有可能导致HILI诊断不准确。因此，本文采用《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》^[8]（以下简称《HILI指南》）推荐的整合证据链^[9]方法，对1例单独服用白鲜皮粉末致药物性肝损伤的典型病例进行临床和实验室系统研究，以期为临床医生及科研人员研究白鲜皮肝损伤的客观真实性和风险因素提供直接可靠的研究证据。

1 材料与方法

1.1 病历摘要

患者张某，女，58岁，主因“乏力、纳差”3个月于2016年3月8日入住解放军302医院。2016年1月患者无明显诱因出现乏力、纳差，伴有手麻，就诊佳木斯大学附属医院，化验查丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）1 686 U·L^-1、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）5 762 U·L^-1，总胆红素（total bilirubin，TBIL）150.9 μmol·L^-1，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）140 U·L^-1，考虑“药物性肝损害”，给予保肝、退黄等对症治疗，胆红素持续上升；2016年2月就诊哈尔滨医科大学第二附属医院，查HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HBsAb均为阴性，抗-HCV、巨细胞病毒抗体、EB病毒抗体、自身免疫抗体均为阴性，诊断“药物性肝损伤”，给予保肝、退黄、补蛋白等对症治疗，乏力、纳差症状好转，TBIL，ALT，AST仍波动性上升，为进一步诊治，于2016年3月8日以“药物性肝损害”收入302医院急诊科。患者于2016年1月1日至1月5日因咽痛持续口服自述为白鲜皮磨制的粉末，15 g·d^-1，并于1月5日出现乏力、纳差等不适，遂停药就诊。否认肝炎病人密切接触史，否认肝炎等传染病史，否认高血压等病史，否认外伤史，否认手术史，否认输血史，否认药物、食物过敏史。无疫水、疫源接触史，无放射物、毒物接触史，无有害粉尘吸入史，无饮酒史，无冶游史。家族中无传染病及遗传病史。入院后患者仍自觉乏力、纳差，查体面色萎黄，皮肤、巩膜重度黄染，未见瘀点、瘀斑，肝掌阴性，未见蜘蛛痣，入院化验：ALT 35 U·L^-1，AST 187 U·L^-1，ALP 110 U·L^-1，TBIL 532.5 μmol·L^-1，HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HBsAb均为阴性，抗-HCV、抗HAV-IgM、抗HEV-IgM、抗CMV-IgM、抗EBV-IgM、自身免疫抗体均为阴性。给以保肝、降酶、退黄等对症治疗，乏力、纳差症状改善，肝功好转，TBIL，ALT水平下降。4月9日查肝功能示ALT 4 U·L^-1，AST 43 U·L^-1，ALP 152 U·L^-1，TBIL 124.8 U·L^-1，患者拒绝肝穿术进行肝组织活检，并要求出院。

1.2 HILI診断流程分析

1.2.1 HILI生化学诊断标准 《HILI指南》中生化学诊断标准采用2011年国际严重不良反应协会建议的DILI生化学诊断标准^[10]：ALT≥5×ULN；或者ALP≥2×ULN，特别是伴有5′-核苷酸酶或γ-GGT升高且排除骨病引起的ALP升高；或者ALT≥3×ULN且TBil≥2×ULN。

1.2.2 排除其他导致肝损伤的原因 通过实验室检查、影像学检查等排除病毒性、免疫性、酒精性、遗传代谢性、胆道疾病、血管疾病等原因造成的肝损伤。

1.2.3 确定肝损伤类型 根据《HILI指南》判断肝损伤类型：肝细胞损伤型，ALT≥3×ULN（正常值上限），且R≥5；胆汁淤积型，ALP≥2×ULN，R≤2；混合型，ALT≥3×ULN，ALP≥2×ULN，2

1.2.4 RUCAM评分 根据《HILI指南》计算RUCAM评分，初步判定服用药物与肝损伤的因果关系。将肝损伤与药物的关系分为“高度相关”（>8分）、“很可能相关”（6～8分）、“可能相关”（3～5分）、“可能无关”（1～2分）、“排除”（≤0分）。《HILI指南》推荐RUCAM≥3分考虑为中草药与肝损伤存在相关性。

1.2.5 排除联合用药 使用《HILI指南》推荐的《药物性肝损伤用药调查表》进行病史和服用药物信息采集，排除应用中有明确肝毒性或相互作用引发药物肝毒性的西药；获取并核实导致肝损伤的中草药及其相关制剂资料。

1.2.6 药物质量检测和基原鉴定 由于此药物来源不明，考虑该药物在生长、加工、炮制等环节受到污染或发生变质，导致中草药农药残留、重金属和微生物毒素等严重超标而引发肝脏损伤^[11-12]，于是获取患者余留药材，按照药典的相关规定对该粉末进行检测；通过对药物的农残、重金属以及微生物毒素检测以排除有害物质污染等因素。

采用DNA条形码技术对此药进行基原鉴定。将药物粉末样品置于2.0 mL EP管中，加入2颗钢珠，用DNA提取研磨仪研磨2 min（30次/s）后，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。PCR扩增、测序、序列拼接及结果判定均依照中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则规定的标准流程操作。

2 结果

2.1 HILI生化学诊断标准

患者服用自述为白鲜皮粉末，满足肝功异常前有中草药及其相关制剂应用史，且其ALT为1 686 U·L^-1，其生化指标符合HILI生化学诊断标准中的ALT≥5×ULN。

2.2 排除其他导致肝损伤的原因

通过实验室检查HBsAg，HBeAg，HBeAb，HBcAb，HBsAb均为阴性，丙肝、巨细胞病毒抗体、EB病毒抗体、自身免疫抗体均为阴性，排除病毒性、免疫性、遗传代谢性、胆道疾病、血管疾病等原因导致的肝损伤，通过BMI、血脂、腹部B超等排除非酒精性脂肪性肝病，通过对饮酒史的询问排除酒精性肝病。

2.3 根据损伤靶细胞类型分型

患者ALT≥3×ULN，计算R为52，根据损伤靶细胞类型分型为肝细胞损伤性。

2.4 RUCAM评分

通过RUCAM评分表，可知患者RUCAM评分为6分，即肝损伤与药物的关系为很可能相关，为疑似诊断HILI，见表1。

2.5 排除联合用药情况

在疑似诊断HILI基础上，通过用药史调查表对患者的用药情况进行调查，排除了联合应用中有明确肝毒性或相互作用引发药物肝毒性的西药，见表2。

2.6 DNA条形码鉴定

通过患者口述，该药物为当地人上山采摘后研制成的粉末，考虑到患者没有生药学知识，可能存在基原鉴定不准的情况。为此对该粉末进行DNA条形码分子鉴定研究，获得该粉末基因组DNA，并经过PCR扩增获得对应ITS2序列为：CGCATCGTTGCCCCACCCCATCCCCTCGGGGCCATGGTGGTGTG- GGCGGAAAATGGCCTCCCGTGGGCTATTCGCTTGC- GGTTGGCCGAAAAATGAGTCATCGGCGACCGAAG- CCGCGACGATCGGTGGTGAAAACAAGCCTCTCGA- GCTCCCGTCGCGTGCCCGTGTCGACGAAATAGTGC- TCAAGGACCCTGACGCTCCGCGTAAGCGGCGCTCG- CATCG。将所得序列在中药材DNA条形码鉴定系统（http：//www.tcmbarcode.cn）和NCBI中进行综合结果判定。ITS2序列BLAST比对后样品结果为：该药物ITS2序列BLAST比对后相似性最高的物种为白鲜D.dasycarpus，相似度为100%；确定为植物白鲜D.dasycarpus Turcz，根据患者主诉服用的为此药物的根皮，确定为白鲜皮^[13-14]。

2.7 化学药物添加排查

鑒于患者所服用药材并非购自正规医疗机构，因此，本文基于Agilent Fake TCM-Drugs数据库，通过采用Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC-MS技术对药材进行化学药物添加检测，该数据库收录了6 500余种化学药添加化合物，基本涵盖了大部分常见化学药添加化合物。结果表明所检测到的化合物质谱中的分子离子峰质荷比数值与数据库提供的化学药添加化合物标准谱中分子离子峰质荷比数值的误差均大于100，提示此白鲜皮粉末未检测出化学药物添加。

2.8 药物的农残、重金属以及黄曲霉毒素检测排查

将患者所服药物送至北京市理化测试中心进行农残、重金属以及黄曲霉毒素等相关项目的检测，检测结果见表3，表明该患者所服药物中农残、重金属以及黄曲霉毒素的含量均符合2015年版《中国药典》中甘草项下相关检测标准。因此，可排除由于农残、重金属以及黄曲霉毒素等外来因素而导致肝损伤的影响因素。

3 讨论

根据《指南》诊断方法和流程，鉴定出该药物基原、排除其混伪品及有害物质污染，初步确定此病例为临床诊断HILI。流程参考《指南》，见图1。

根据课题组前期调研发现，一些传统无毒中药临床肝损伤大多与特异质有关^[15]。现代医学和毒理学研究表明，基因、免疫、体质等因素都可能是药物特异质毒性的诱因^[16-18]。传统中医对体质与药物耐受性的关系也有认识，如《类经·卷四·藏象类·耐痛耐毒强弱不同》云：“人有能胜毒者，有不能胜毒者。”《灵枢·论痛》云：“胃厚色黑大骨及肥者，皆胜毒；故其瘦而薄胃者，皆不胜毒也。”此外，由于遗传、生活习惯等因素，有人对某味药特别敏感，容易发生中毒，相反，有人因耐受性强，比较不容易中毒^[19]。临床调查期间发现，在该患者当地有服食白鲜皮粉末治疗嗓子疼痛的习惯，根据患者口述大部分人服食后未见不良反应。因此，推测该患者发生肝损伤可能与其特异质有关。

此外，该例患者肝损伤可能与其未按照中医辨证用药有关。古人云：“（药物）用之得宜，皆有功力；用之失宜，参术亦能为害。”^[20]临床用药未能准确辨证，是影响中药安全性的重要因素，用药对症则是保证中药安全、有效的基础，药物是以纠偏治病的，如果药不对症，违背治疗原则很容易导致新的病理偏向，给人体造成伤害，表现出毒性。白鲜皮性苦寒，归脾、胃、膀胱经，传统不用于上呼吸道感染的治疗，根据中医辨证用药以及西医对症用药等原则，此病例属于超适应症的使用，这种不对证（病）应用药物很有可能增加肝损伤的风险。

通过文献检索发现，白鲜皮地上部分含有补骨脂素等成分，类似的成分在中药补骨脂中也存在，而补骨脂及其相关制剂有较多文献研究提示会导致肝损伤风险^[21-22]，国家药品不良反应监测中心2次通报过含有补骨脂的壮骨关节丸可导致肝损伤。因此，白鲜皮肝损伤风险值得做深入的研究，并且可关注补骨脂素等成分致肝损伤风险的研究。

临床中并非所有人服用后均产生肝损伤，表明白鲜皮所致肝损伤可能与服用者的特异质有关。然而至今并没有针对白鲜皮致肝损伤的流行病学调研，对白鲜皮致病的发生因素以及易感性等都缺乏研究。经检索，本文是首例单独服用白鲜皮导致肝损伤的典型病例报道，通过对该患者服用药物的系统排查与检测，最终确定该病例为白鲜皮导致肝损伤，但仍需尽快在临床和实验室开展对白鲜皮的深入研究，为后续研究白鲜皮肝损伤风险提供直接临床病例证据。

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[责任编辑 曹阳阳]