多元组学背景下地黄连作障碍形成的分子机制研究进展

李明杰+冯法节+张宝+古力+王丰青+杨艳会+田云鹤+陈新建+张重义

[摘要]连作障碍的研究虽然已经有多年的历史，但目前仍没有有效的治疗方法，其根本原因是其形成体系的复杂性。该文从连作植物根际土壤多元因子的互作关系入手，详细阐述了栽培植物连作障碍形成的生理生态机制，提出了栽培药用植物、自毒化感物质和根际微生物间复杂的多元互作是驱动连作障碍形成的根本原因，指出了植物功能基因组学和代谢组学以及微生物宏组学相结合的多元组学技术在深入理解特定生境多因子互作关系研究中的优势。同时，该文以地黄为例，从根际化感自毒物质累积效应、根际微生态的灾变及连作植株的分子响应等多元角度综述了地黄连作障碍形成的分子机制，并详细总结了多元组学技术在这些机制研究中的运用和进展。该文为从分子水平上系统地揭示栽培药用植物连作障碍形成的分子机制提供了新的思路。

[关键词]地黄； 多元组学； 连作障碍； 分子机制； 栽培药用植物

[Abstract]Although consecutive monoculture problems have been studied for many years， no effective treatments are currently available. The complexity of systems triggered the formation of consecutive monoculture problems was one major cause. This paper elaborated the physiological and ecological mechanisms of consecutive monoculture problem formation based on the interaction relationship among multiple factors presented in the rhizosphere soil of consecutive monoculture plants. At same time， in this paper the multiple interactions among cultivated medicinal plants， autotoxic allelochemicals and rhizosphere microbial were proposed to be most important causes that derived the formation of consecutive monoculture problem. The paper also highlighted the advantage of 'omics' technologies integrating plant functional genomics and metabolomics as well as microbial macro-omics in understanding the multiple factor interaction under a particular ecological environment. Additionally， taking R. glutinosa as an example， the paper reviewed the molecular mechanism for the formation of R. glutinosa consecutive monoculture problem from the perspective of the accumulation of allelopathic autotoxins， the rhizosphere microecology catastrophe and theresponding of consecutive monoculture plants. Simultaneously， the roles of mutilple 'omics' technologies in comprehending these formation mechanism were described in detail. This paper provides finally a new insight to solve systematically the mechanism of consecutive monoculture problem formation on molecular level.

[Key words]Rehmannia glutinosa； mutil-omics； consecutive monoculture problem； molecular mechanisms； cultivated medicinal plants

隨着现代中药农业的发展，药用植物大面积单一化连续种植，导致中药材产量降低、品质变劣、生长状况变差、病虫害加重等连作障碍现象日趋严重^[1-2]。连作障碍现象在我国农业生产中普遍存在，在药用植物上表现尤为突出。据统计，约占70%以上的根（根茎）类药材人工种植时均存在不同程度的连作障碍，如人参、三七、地黄、黄连和当归等^[3-5]。由于许多药农对连作障碍缺乏科学的认识，盲目加大农药和肥料的使用，以期防治病虫害和提高产量，致使生产成本大幅增加、农药残留超标、药材品质下降，严重制约了药用资源的可持续利用和区域经济的发展。同时，连作导致中药农业生境破坏、生物多样性下降、生态位变窄，过度使用的农药、化肥又加剧了农田生态系统的恶化，中药资源可持续发展受到空前严重的威胁和巨大的挑战。因此，连作障碍问题的研究已成为制约中药资源可持续利用和影响中医药行业健康发展的战略性课题，也是当前中药资源生态学迫切需要解决的重要内容，成为国内外同行研究的热点。

1 栽培植物连作障碍形成的生理生态机制

1.1 连作障碍的形成与化感自毒作用 目前关于栽培药用植物连作障碍的研究虽有大量的报道，但对其形成机制仍处于探索之中。越来越多的研究表明，栽培植物根际自毒物质的持续性积累及其所引发的根际灾变可能是造成连作障碍的主导因素^[6-9]。植物在正常的生命活动过程中，会通过自身分泌、茎叶淋溶及残体分解等方式向环境不断释放一些影响其他植物生长的次生代谢物质，这些次生代谢物质在土壤中持续累积，对植物本身也产生毒害作用，即化感自毒作用（allelopathic autotoxicity），这些分泌物则被称为自毒化感物质（autotoxic allelochemicals）^[6]。植物中所发现的自毒化感物质主要来源于有机酸、醛类芳香酸、香豆素、醌类、生物碱和类萜等植物次生代谢产物，其中酚类和类萜类化合物是高等植物的主要化感物质。任何植物都不可能只产生一种或几种化感物质，植物化感作用往往是众多化感物质相互作用的结果。植物所生成化感物质不论种类多少，其化感作用强弱通常与其对应浓度呈正相关，表现出“低促、高抑”现象^[6，10]。比如：在地黄栽培实践中，只有完整种植地黄一年的地块才会对再植地黄产生强烈的伤害现象。此外，连作伤害的发生与植物所处的生长发育状态也存在着较为密切的关系。比如连作地黄伤害的关键期往往发生在拉线期前期（幼苗后期）^[11]，生产中常会采用育苗移栽的方法跳过此敏感期，来减缓连作伤害。

1.2 化感自毒作用与根际生态灾变机制 栽培植物根际土壤是一个有生命的、动态的多元世界，聚居着细菌、放线菌、真菌、藻、原生动物和病毒，它们对土壤肥力的形成、植物营养的转化起着极其重要的作用。在药用植物连作后，根际化感物质却介导了土壤微生物的趋化过程，选择性的吸引了病原微生物在根面、根际定殖和扩繁，营养分配不均导致根际微生物趋化失衡，降低了原本根际微生物多样性，导致有益微生物减少，恶臭假单胞菌、河生肠杆菌、多形屈挠杆菌等有害微生物大量滋生，引起了根际微生物群体从“细菌型”向“真菌型”的不利转变。由于大量真菌病原物侵染植物根部，导致其碳水化合物、氨基酸、蛋白质、脂类和核酸等物质代谢的改变，使根的分泌作用加强^[12-13]。根际化感物质除了可以诱导根际微生物的群体失衡外，有研究也认为萜类化感物质能够抑制细胞ATP 形成和植物生长、干扰线粒体发挥正常功能、阻碍植物对矿物质的吸收、引发膜过氧化毁坏细胞膜结构^[6]。由于化感物质对细胞膜的具有较强损伤性作用，往往会导致细胞内含物不断外泄，加速了土壤内化感物积累，反作用于根际微生物群落加重根际灾难，造成恶性循环^[14]。由于遭受自毒化感物质伤害作用和根际土中大量微生物病菌不断增值的“双重攻击”，连作植物最终不堪重负、逐渐衰弱。

生态系统的调控过程是相互促进（相生）或相互抑制（相克）的协调过程。连作障碍形成及加重发生的原因不是单一或孤立的，而是“栽培植物-土壤-微生物”系统内多种因素综合作用的结果，其主要根源在自毒物质诱导下的根际微生态失衡^[5]。因此，连作障碍形成涉及到复杂的多元系统，包含大量未知化感物质、微生物群体和植物的复杂响应。虽然连作障碍的研究已经经历多年的历史，但对于连作障碍的形成机制仍然缺乏统一的定论，其根本的原因就在于系统的复杂性和缺乏相应的解读工具。近年来，随着宏基因组学和功能基因组学高通量测序技术的快速发展，高效、批量鉴定特定环境中微生物整体构成和监视特定生理状态下植物基因、蛋白和代谢物的变化已经成为现实。因此，有效的组合功能基因组学和宏组学能够显著弥补目前连作障碍研究中的不足，有效实现连作障碍复杂体系中多元因子的动态解析。

2 功能基因組学和微生物宏组学

2.1 植物功能基因组学 功能基因组学是指利用基因组学提供的信息作为基础，进一步深入研究基因转录为信使RNA的方式、编辑并指导蛋白质合成的机制（转录组学，transcriptomics）、蛋白质表达及其活动规律（蛋白质组学，proteomics）、DNA序列不发生改变的表观遗传调控（表观组学，epigenetics）以及它们如何影响那些控制细胞生物化学和代谢的化学物质（代谢组学，metabolomics）。功能基因组学更多的应用高通量、大规模的实验方法，结合统计科学和计算机分析来探索基因、表观修饰、蛋白质和代谢产物的规律，并最终阐释基因组信息和表型性状之间关联性的学科^[15]。

转录组学是一门在整体水平上研究细胞中所有基因转录及转录调控规律的科学。它能提供基因组转录出来的全部RNA信息的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。随着科学研究的不断深入，多种新技术和方法已成功应用于转录组学的研究，比如：表达序列标签（expressed sequence tag， EST）、cDNA-AFLP（amplified fragment length polymorphism）、抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）、基因芯片（gene chip）、新一代转录组测序技术（RNA-sequencing，RNA-Seq）等。值得一提的是，RNA-Seq测序技术省去了传统测序方法中从构建文库到获取序列信息的繁琐过程，可以在较短的时间内获取大量数据信息，其测序量达到传统Sanger测序法的几百到几千倍，而测序的成本仅为传统技术的几十分之一。

蛋白组学则是以该细胞或组织内全部的蛋白或肽段作为研究对象，以更接近基因表达的实际生理功能的角度去阐述多个基因的作用方式。过去对蛋白的分析基本上集中在单一蛋白研究，在蛋白组学的概念提出以后，相关技术的快速进步使大规模、同时间分析多个肽段序列已经成为现实，突破了转录组学的研究限制，是对基因组学的广泛延伸。目前蛋白组学中的常见鉴定和分析技术有：双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis，2D-PAGE）、荧光染色技术（two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis，2D-DIGE）、iTRAQ技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation）。iTRAQ技术与传统蛋白鉴定和定量技术相比，已经实现了批量蛋白鉴定功能，最多可同时对8组样品的蛋白进行标记，并进行绝对和相对定量分析，效率和精准度都得到了空前提高。

代谢组学旨在研究生物体或组织甚至单个细胞的全部小分子代谢物成分及其动态变化。它反映的是生物体在受到外界刺激或经遗传修饰的细胞或组织所产生的代谢响应变化。最早提出的“代谢物组”（metabolome）是指某一生物或细胞所产生的所有代谢物，之后发展成为代谢组学。代谢组的分离和鉴定技术有：气相色谱-质谱联用（gas chromatography with mass spectrometer，GC-MS）、液相色谱-质谱联用（liquid chromatography with mass spectrometer，LC-MS）及毛细管电泳-质谱联用（capillary electrophoresis coupled mass spectrometer，CE-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、傅里叶变换-红外光谱（fourier transform infrared，FTIR）、飞行时间质谱（time of flight，TOF）等。通过不同代谢组学技术之间的合理搭配和使用能够精准地对植物体或环境中的代谢物进行分析。植物的药用活性成分和化感自毒物质均来自于植物的代谢物，因此代谢组学对于连作植物化感物质的鉴定和解读具有重要的意义。

携带遗传信息的DNA转录为mRNA，再到翻译成有功能的蛋白，进而决定生物的表型性状，构成了遗传学“中心法则”的经典内容。然而在生命活动过程中，生物的遗传性状并不是完全由DNA序列变化所决定。在不改变DNA序列的前提下，基因的表達却发生了可遗传的改变，造成可遗传的表型变化，被称为表观遗传。表观遗传学是通过 DNA 甲基化、组蛋白共价修饰、染色体重塑和非编码 RNA 调控等方式使特定基因的表达发生改变，而不改变其本身的遗传信息，并且这种改变能在有丝分裂和减数分裂过程中稳定遗传，从而调控特定的生物学过程。目前有大量的方法可用来研究植物的表观遗传学规律，比如DNA甲基化的研究方法有：甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）法和以免疫学为基础的甲基化DNA 免疫共沉淀（methylated DNA immuno precipitation，MeDIP or mDIP），而非编码RNAs的表观调控主要通过高通量测序和生物信息学等技术。

2.2 微生物宏功能组学 植物功能基因组学解释的是植物某一个或一类性状背后的遗传决定机制，而宏基因组学则针对是一类生物，特别是环境中的微生物群落整体的功能特性。宏基因组学研究主要分成2个层面，一是对特定环境中全部微生物的总DNA进行深度测序，分析该生境中微生物的组成与相关功能；二是根据rDNA或目标基因上特定片段进行大规模测序，通过系统分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。直接对土壤宏基因组测序的报道较少，主要是由于物种序列复杂程度较高造成拼接困难，目前主要通过高通量技术测定群体微生物16S rDNA 信息来判定群体中微生物多样性。因此，宏基因组测序主要包括宏基因组文库的构建和宏基因组文库进行分析和筛选。除了高通量测序技术测定微生物文库外，16S rRNA宏基因组文库的分析还包括：变性梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis， DGGE）、限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、末端标记限制片段多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、单链构像多态性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）技术等。尽管宏基因组学研究提供了很多有价值的数据，但如果不对特定条件的蛋白表达进行研究，人们就不能彻底对环境微生物生态进行分析。因此，宏蛋白组学和宏转录组学应运而生。根际宏组学更多是包含微生物在内的多个物种群体在某一特定环境、特定时期全部基因组转录情况。因此，宏基因组学和宏蛋白组学进一步拓展和延伸了宏基因组学的内涵，探索了微生物群落的基因表达与调控，为揭示微生物群落功能的直接表征奠定基础^[16]。

3 多组学在地黄连作障碍形成机制中的运用

地黄Rehmannia glutinosa L.是玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国传统的大宗道地药材，现已广泛栽培。然而，地黄连作障碍问题表现尤为突出，连作地黄生长不良，块根不能正常膨大，病虫害加剧，产量和品质明显下降，甚至绝收，而且头茬地黄收获后须隔8～10年后方可再种。地黄连作障碍仅只伤害其自身，而对其他植物（禾本科、豆科等）却影响不大，如地黄的茬口对下茬的作物如小麦、玉米、牛膝等。由此可见地黄连作障碍具有明显的针对性，并不具备“普遍性”。正是由于地黄的连作障碍表现出严重性、特异性和持续性的典型特点，使其成为研究作物连作障碍形成机制的优异实验材料。目前，地黄连作障碍形成的机理轮廓已经基本清晰，如何让这个轮廓更加精细，需要结合不同组学对连作障碍中的每个环节进行一一鉴定。在地黄连作障碍的形成机制研究中，本课题组中已经通过各种组学技术的有效结合对连作形成关键的环节进行了详细的解读。

3.1 地黄根际自毒化感物质鉴定与代谢组学 目前，课题组已经利用GC-MS，HPLC等代谢组学技术详细探究了连作地黄土壤中化感物质的作用部分、种类及分泌和释放的规律。比如：李振方等用水浸提和“石油醚-氯仿-乙酸乙酯-甲醇”联合分步、分部位提取地黄根区潜在的化感物质，通过生物测试发现水、甲醇提取物有显著的化感效应^[17]。陈枫等以

70%甲醇提取地黄茬后根际土壤，并用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取获取不同极性的部位，种子发芽和田间盆栽试验表明正丁醇和水部提取物具有明显的化感效应，并且正丁醇部对盆栽地黄块根的生长抑制作用显著超过水部^[18]。为了更精确的鉴定连作地黄土壤中的化感自毒物质种类及分布，朱广军等采用GC-MS 对通过吸附树脂所获取的地黄根区土壤浸提液进行物质种类鉴定，发现在地黄根区土壤中存在有机酸、醇、酚、醛、酚酸等有机化合物，且地黄根区土壤种类远多于对照土壤^[19]。郝群辉等采用GC-MS鉴定地黄根际土壤水提物，发现12种地黄根际特异化感物质，其中，有超过一半属于酚类物质^[20]。李振方等用GS-MS方法从地黄的须根中鉴定得到32个代谢物，选择9个复合物进行化感活性测定，发现其中7个酚酸物质有显著化感活性^[21]。郜峰等以砂粒为基质培养地黄苗，用XAD-4柱的循环收集系统即时吸附根系分泌物，通过GC-MS鉴定收集液成分，结果在分泌物中获取3，5 -二叔丁基-4-羟基苯甲酸和阿魏酸2种丰度较高的化感物质^[22]。

自毒化感物质存在于根际土壤中，那么根际土壤中的自毒物质辐射范围到底有多大，如何界定等目前并没有明确的定论。为了精确界定地黄土壤中自毒化感物质的分布范围，课题组通过生物测试比较了地黄不同根区土壤浸提液对自身种子生长的影响。结果发现距离地黄块根越近，地黄种子胚根生长受抑制的作用越大，当距离超过20 cm时地黄种子胚根的生长不被抑制。同时，通过GC-MS技术对不同根区甲醇和正戊烷土壤浸提液进行鉴定，发现地黄种植后距离块根20 cm范围内的土壤中新增了20种物质，且这些物质不存在于圈外及未种植过地黄的土壤中，其中，茉莉酮酸甲酯、1，2-亚甲二氧基-4，7二甲氧基-5-苯甲醛、7，10，13-十六碳三烯醛、9-十六碳烯酸和棕榈油酸等已被报道具有较强的化感活性。因此，通过上述的研究可以初步的判定地黄根际化感物质分泌范围大约为20 cm^[24]。连作地黄根际土壤中积累了大量的化感自毒物质会对地黄造成严重的伤害效应，但这种效应能够维持多久，换句话说，含有一定含量自毒化感物质的土壤，需要多长时间的自然消减才能种植地黄。为确证酚酸类化感物质在土壤中的存在和变化状态，杜家方等采用HPLC检测2，4，6，8年前种植过地黄的土壤中与化感现象密切相关的5种酚酸（阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香豆酸和丁香酸）的含量。结果发现土壤中5种酚酸的含量依次降低，说明随着连作土间隔年限的延长，土壤中的化感物质可以消减到一个较低的浓度^[25]。

3.2 地黄根际微生物群落鉴定与宏基因组学 目前，课题组已经利用T-RFLP，DGGE及宏蛋白組学等方法对连作地黄根际微生态环境进行详细的研究。张重义等利用T-RFLP技术研究了连作地黄根际土壤中细菌群落的动态变化，发现连作地黄土壤中细菌优势种群的比例显著下降，致病菌群的比例显著上升^[26]。吴林坤等通过T-RFLP和PLFA（phospholipid-derived fatty acids）技术分析了野生地黄头茬、连作和原茬土壤及未种植任何作物土壤根际微生物的群落结构，发现连作地黄土壤微生物总量显著降低，细菌/真菌比例下降，大量病原菌迅速滋生^[27]。张宝等利用DGGE对地黄不同根际区间土壤的微生物群体进行分析，发现地黄连作会引起土壤根际、根外土壤细菌数量减少；进一步利用DGGE分析头茬和连作地黄生长过程中根际微生物变化，发现随着地黄发育进程推进，根区土壤细菌数量大幅降低，而木霉黄、曲霉等真菌数量显著增加^[24]。土壤是一个极其复杂的“黑匣子”，若仅从土壤微生物、植株体自身等某一个侧面进行探讨，很难真正反映连作障碍的成因，但应用土壤蛋白质组学研究根际生物体间的互作，则直接可以从土壤系统功能的水平上，揭示土壤中各生物体间以及生物体与环境间的相互作用，从分子水平揭示地黄根际微生态系统中根系分泌物、土壤微生物、植物间的互作关系。为此，课题组通过2-DE和MALDI TOF-TOF MS质谱相结合的方法，在根际土壤鉴定了103个蛋白，其中33个在连作一年或两年根际土壤出现显著表达变化，这些蛋白来源植物或微生物，广泛的参与蛋白、核酸的次级代谢、信号转导、胁迫响应及根际土壤生态系统C，N的循环。此外，参与酚酸代谢的苯丙氨酸解氨酶在连作中上调表达，这与随着连作年限增加土壤总酚酸含量增加的结果相一致^[28]。

通过上述分析可以发现连作地黄所分泌的自毒物质显著诱导了土壤微生物群体改变，打破了土壤原有微生物群落平衡，导致大量病原真菌迅速增殖，破坏地黄的生理代谢进程，使植株生长受到严重抑制，甚至死亡，这也更加证实了地黄所分泌的化感自毒物质与连作根际微生物互作关系是加重连作障碍发生的重要原因。为进一步理解根际土壤生态系统中微生物和植物间的互作关系，本课题组基于宏蛋白质组学、宏基因组学的分析结果，将研究重点集中于锁定的有益菌和病原菌，通过微生物可培养法与qRT-PCR技术对锁定的特异关键微生物类群数量变化进行分析，同时借助构建的组培苗体系，通过室内模拟连作环境来进一步研究根系分泌物介导下微生物-微生物、植物-微生物之间的互作关系。结果发现模拟根际土壤中各酚酸配比的混合酚酸能够显著促进病原菌尖孢镰刀菌的菌丝生长、孢子产生以及DON毒素的产生，尤其是香草酸和阿魏酸的促进效果最强，相反，该混合酚酸能够显著抑制有益拮抗菌假单胞菌W12的生长，其中香草酸和阿魏酸的抑制效果刚好最强，而它们也是地黄根际土壤中含量较高的2类酚酸。可见地黄根系分泌物中的主要化感物质对土壤微生物类群具有选择塑造作用，能够选择性促进或抑制某些特异微生物的生长^[29]。

3.3 植物功能基因组学与连作地黄分子响应机制 随着土壤化感物质的逐渐增多和微生物群落失衡，连作地黄所处生长环境愈加恶化，面对恶化的环境，连作地黄的生长发育受到严重抑制。然而，面对连作土壤恶劣的环境时，植物是如何感知、响应进而呈现出伤害症状的呢？为了深入解读连作对地黄的分子伤害机制，课题组利用SSH技术构建了头茬与连作地黄消减cDNA文库，鉴定了部分连作响应的特异表达基因；利用高通量测序技术构建了地黄转录组文库及头茬与连作地黄根部、叶片差异基因表达谱，初步筛选了响应连作地黄的差异表达基因。通过对上述不同文库差异表达基因的分析，课题组提出连作障碍感知、响应和发生过程中的几个关键性决定事件，即：钙信号转导，乙烯产生和组蛋白修饰^[30-32]。目前，课题组通过不同实验方法已初步验证了钙信号和乙烯在连作中的重要性^[33-36]。就地黄本身而言，连作伤害可能来自2个层次：一是自毒物质的直接伤害；二是微生物失衡所致的间接伤害。因此，连作伤害发生过程中一些关键分子事件很可能是连作根际土壤中多元生物或非生物胁迫复合作用的结果。近年来，化感物质对植物伤害的分子机制在不同作物中也取得了一定进展，如Chi等通过RNA-Seq和基因芯片方法研究了自毒物质胡桃醌和阿魏酸胁迫下水稻的响应机制，发现2种自毒物质均能激活水稻体内钙信号和乙烯信号途径^[37-38]。此外，课题组也发现连作伤害进程与异生素（xenobiotics）对植物伤害机制模式基本类似^[39]，侧面表明了生物应对不同生物胁迫或非生物胁迫可能存在着相似的响应机制。与转录组学相比，蛋白变化更能真实反映出植物面对胁迫时细胞内真实响应状态，为了从蛋白层面上研究地黄在面对连作胁迫时的响应机制，课题组利用2-DE技术对头茬和连作地黄叶片进行差异蛋白分析鉴定到290个显著差异表达蛋白，其中，与光合作用、能量合成、细胞分裂及代谢相关的蛋白在连作地黄中显著下调，而与抗病相关的蛋白在连作中显著上调。表明连作地黄的光合作用受到显著抑制，细胞分裂和细胞代谢受到显著干扰，抗病性显著减弱^[8]。同时，课题组进一步利用2-DE技术分析头、重茬地黄块根蛋白表达谱，发现与块根重要生理代谢过程和主要成分合成相关的蛋白在连作地黄中下调；与胁迫响应、抵御相关的蛋白在连作均上调，表明连作胁迫可导致地黄蛋白表达紊乱，植株生理代谢过程异常，碳水化合物和能量代谢缓慢，产生连作障碍效应^[40]。

在植物面对逆境胁迫时，基因的表达与否受到组蛋白甲基化、乙酰化等大量表观修饰的调控。连作作为一种特殊的环境胁迫，必然会引起连作地黄体内复杂的表观修饰变化。Yang等利用MSAP技术分析了连作地黄根细胞基因组的胞嘧啶甲基化状态的变化，通过比较头茬与连作地黄中的592个DNA甲基化多态性片段，发现连作引起了根细胞DNA甲基化位点增加，其中，甲基化修饰的基因主要有MYB转录因子、反转座子、植物色素B等与基因表达和植物正常生长发育相关的基因，这些基因被甲基化后DNA的空间结构发生改变而无法正常转录，致使地黄体内正常基因的表达程序出现紊乱^[41]。基因能否转录为蛋白发挥正常功能，需要经历转录后剪切、修饰等复杂调控过程，而 miRNAs在这个过程中起着重要作用。Yang等通过头、重茬地黄sRNA差异表达谱分析获取了大量显著差异表达miRNAs信息，利用降解组测序对差异miRNAs靶基因进行鉴定发现地黄miRNAs参与了连作地黄转录调节、激素代谢、信号传导、逆境响应等核心的生物学过程^[42-43]。从以上现有的转录组，蛋白组和miRNAs组等结果说明地黄在不同水平上均受到了连作胁迫的影响。其影响的最终结果造成地黄生长发育的错乱，表现出连作障碍效应。

4 展望

地黄连作障碍形成机制研究带来了许多新的启示，连作障碍的形成绝非某一个或某几类因素所决定的。连作障碍的形成涉及从栽培植物—土壤微生物—再到植物复杂互作和响应体系，而这种多元互作体系却在土壤“暗箱”内上演。正是由于连作障碍形成因素的复杂性和隐蔽性给研究带来重重困难。随着多学科的相互交叉和大量研究工作投入，目前研究组基本上把住了地黄连作障碍形成的脉络，即自毒化感物质及其所诱发的次生灾变机制是连作障碍形成基本原因。然而，由于化感物质类种类繁多、根际微生态复杂性和植物响应多边性，很难用常规的方法去解释连作障碍形成机制。这种系统的复杂程度，很难用一个或若干个因素去阐明。就如同很难用质量性状的遗传分离规律去解释数量性状一样，连作犹如一个遗传复杂的数量性状，所呈现出的症状是外界复杂的环境因子和内部众多的响应基因综合作用结果。过去用单一生理生化方法对连作现象的解释很容易坠入“管中窥豹”的结果。所谓“解铃还须系铃人”，由于连作障碍是多系统之间的互作使然，应该整合多元组学并用系统的思维或方式去寻找連作复杂因素背后真实规律。近年来随着多元组学和系统生物学算法的进步，为以后从多角度、多层次、整体性的去解读连作障碍的形成机制提供了重要的工具。相信随着不同组学通量和鉴定精度的不断提高，发现和最终确证连作障碍形成分子机制也近在咫尺。

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[责任编辑 吕冬梅]