石杉碱甲对D-半乳糖诱导老年性聋神经纤维的保护作用

李聪 顾健 敖华飞 阮清伟 孔德秋

·基础研究·

石杉碱甲对D-半乳糖诱导老年性聋神经纤维的保护作用

李聪 顾健 敖华飞 阮清伟＊孔德秋

目的 研究石杉碱甲(Hup A)对D-半乳糖(D-gal)诱导的老年性聋大鼠耳蜗神经纤维的保护作用。方法 3～4周Sprague-Dawley雄性大鼠30只，随机平均分为3组，模型组用5%D-gal(200 mg/kg)行颈背部皮下注射制备老年性聋模型，D-gal+Hup A组为大鼠颈背部皮下注射同体积5% D-gal(200 mg/kg)和Hup A(0.1 mg/kg)，对照组予同体积生理盐水作颈背部皮下注射，均连续注射8周。β-半乳糖苷酶染色耳蜗衰老细胞；同时用免疫组织化学方法检测各组用药后神经纤维数目的变化。结果 模型组耳蜗衰老细胞密度最高，D-gal+Hup A组和对照组却差别不大。免疫组织化学检测结果分析，D-gal+Hup A组神经纤维的数目和对照组无明显差异，而模型组神经纤维数目明显少于D-gal+Hup A组(P<0.05)。结论 Hup A对D-gal诱导的老年性聋的神经纤维具有保护作用。(中国眼耳鼻喉科杂志，2014，14：177-180)

石杉碱甲；D-半乳糖；老年性聋；神经纤维；保护作用

老年性聋又称年龄相关性听力下降，主要指随着年龄的增加，在排除噪声、耳毒性药物和遗传因素的情况下，听觉器官随同身体其他组织器官一起发生的老化过程。主要表现为双耳渐进性、对称性的感音神经性听力损失，以高频听力下降为主，伴言语识别率降低等[1]。但迄今为止，老年性聋的防治仍然是尚未解决的难题。石杉碱甲(Huperzine A, Hup A)素有“植物中的黄金”之称，已经在临床上用于治疗阿尔兹海默病等神经退行性疾病[2-3]。本实验组拟通过注射D-半乳糖(D-galactose,D-gal)模拟机体衰老机制制备老年性聋模型，观察石杉碱甲是否具有保护耳蜗神经纤维的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Sprague -Dawley(SD)雄性大鼠(3～4周)30只，体质量220～250 g，购自复旦大学实验动物科学部，动物合格证编号为SCXK(沪)2009—0019。耳廓反射灵敏，动物均无强噪声暴露及耳毒性药物使用史。

1.1.2 实验试剂 Hup A(商品名：双益平)购于上海复旦复华药业有限公司(批号：090504)，D-gal购于美国Santa公司，神经纤维200(neurofilament 200, NF200)抗体购于Abcam公司，衰老特异性β-半乳糖苷酶染色试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 所选的SD大鼠在清洁安静的环境下适应性喂养1周，随机平均分为以下3组。

1)模型组：用5%D-gal(200 mg/kg)进行颈背部皮下注射，连续8周。

2)D-gal+Hup A组：用5%D-gal(200 mg/kg)和Hup A(0.1 mg/kg)配成与模型组同体积溶液行颈背部皮下注射，连续8周。

3)对照组：SD大鼠10只，予以同体积生理盐水行颈背部皮下连续注射8周。

1.2.2 组织准备 上述模型制备后将各组的SD大鼠经戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，开胸后用4%多聚甲醛行心脏灌注。迅速断头，取出耳蜗，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃过夜。常规行10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙2周。后行梯度脱水，先浸入15%蔗糖溶液，再浸入30%蔗糖溶液，至组织块下沉。所有组织块均在液氮中保存，在-20 ℃的恒冷切片机上以5 μm厚连续冠状切片，制作冷冻切片。

1.2.3 衰老特异性β-半乳糖苷酶染色衰老细胞 取各组SD大鼠的螺旋神经节冷冻切片，置于适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液中，室温固定15 min。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)浸泡洗涤组织3次，每次不少于5 min；吸除PBS，加入适量染色工作液；按细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒配置，37 ℃孵育过夜，光学显微镜下观察。

1.2.4 免疫荧光染色 取各组SD大鼠的螺旋神经节冷冻切片于室温下30 min，置入4%丙酮固定10 min，0.01 mmol/L PBS漂洗5 min，共3次；用3%过氧化氢孵育5 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；再用0.01 mmol/L PBS漂洗5 min，共3次；小牛血清封闭非特异性抗原1 h，滴加NF200抗体(1∶1 000)；加四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)山羊抗兔免疫球蛋白G，室温孵育30 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次， 3 min/次；苯基吲哚封片，荧光显微镜下观察。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0进行统计分析，数据统计描述采用均数±标准差，采用t检验对计量资料进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-半乳糖苷酶染色衰老细胞 如图1所示，耳蜗组织中，老年性聋模型组β-半乳糖苷酶阳性细胞密度比对照组明显增高，而D-gal+Hup A组和对照组的β-半乳糖苷酶阳性细胞密度差别不大。

图1. β-半乳糖苷酶染色衰老细胞(图中蓝色即为衰老的螺旋

2.2 神经纤维的免疫荧光染色 3组SD大鼠耳蜗螺旋神经纤维的免疫荧光结果见图2。为进一步量化神经纤维的数目，进行了记数。由染色照片和统计图可知：与对照组相比，模型组神经纤维的数目明显减少，差异存在统计学意义(P<0.05)；而D-gal+Hup A组的神经纤维数目无明显减少，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和D-gal+Hup A组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

老年性聋是人体老化过程在听觉器官中的表现，发病机制较为复杂，至今还没有统一的发病机制理论[4]。近年来最重要的进展是认同氧化应激，其中线粒体老化计时假说[5]最引人瞩目。该理论认为，线粒体氧利用率高，是活性氧的主要亚细胞来源。当活性氧的产生和清除之间失去平衡，就会出现氧化应激。活性氧对生物大分子具有很强的破坏作用，可导致线粒体DNA、细胞等的广泛损伤，内源性抗氧化酶减少，线粒体膜稳定性破坏，向细胞释放细胞色素C，通过级联反应激活caspase-3，最终导致细胞凋亡。因此，设法减少机体氧自由基的产生， 改善抗氧化防御和氧化损伤的修复功能，将大大提高老年性聋的防治水平。

图2. 神经纤维免疫荧光染色和记数(红色为NF200抗体染的神经纤维，蓝色为DAPI染的细胞核；×400)

目前应用大鼠、小鼠等动物构建的衰老动物模型主要有：D-gal致衰老动物模型[6]、SAMP系小鼠衰老模型、去胸腺衰老模型、自然衰老模型等。与其他衰老动物模型相比，D-gal致衰老模型因其造模方法简便易行、成本低廉、结果稳定及造模周期相对较短等优点已成为国内公认的衰老动物模型。Chen等[7]近年来利用颈背部皮下连续注射D-gal建立了大鼠内耳和听觉中枢拟老化的动物模型，该模型动物表现出一系列与自然老化动物相似的行为和生化指标。故在本实验中我们采用了此模型。

目前普遍认为D-gal诱导衰老的假设机制[8]有以下几个方面：大剂量的D-gal在体内不能完全被代谢为葡萄糖利用，剩余的在肝脏中生成半乳糖醛醇和H2O2，半乳糖醛醇不被代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍、脆性增加，致使细胞损伤；H2O2的大量生成导致细胞应激增加，进而导致氧自由基的增加，最终引起细胞老化。本实验的模型组结果显示，细胞老化和神经数目的减少，正好印证D-gal成功致衰老模型。

Hup A是从草药蛇足石杉中分离得到的一种新型石松类生物碱有效单体。大量研究显示，Hup A通过抗凋亡、抗氧化、减弱谷氨酸介导的兴奋性细胞毒性等多靶点作用起到神经保护作用。又因其具有易透过血-脑屏障、口服生物利用度好，且持续作用时间更长和外周不良反应少等优点，目前已在临床上用于阿尔兹海默病、重症肌无力、精神分裂症以及其他神经退行性疾病的治疗。故本实验利用Hup A的此优点研究其对老年性聋的耳蜗神经纤维是否具有保护作用。

本实验采用了直观观察细胞衰老的方法。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。衰老细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且细胞周期分布也比较特殊，不同于细胞凋亡时抑制的情况。在普通光学显微镜下，该衰老特异性试剂仅在衰老细胞中变成蓝色，进而直观观测到细胞或组织的衰老情况。光学显微镜下观察到模型组衰老细胞密度明显高于D-gal+Hup A组和对照组，说明造模成功。组间对比间接说明：Hup A抑制了D-gal引起的细胞衰老。此方法直观、简洁地观察了耳蜗中衰老的螺旋神经节细胞，但是存在不精确的缺点，所以我们进一步做了免疫荧光染色，两者的结果是一致的。

在前期的实验[9]中，我们已经通过检测听性脑干反应对各组大鼠各波潜伏期的变化进行了观察，D-gal+Hup A组听性脑干反应阈值出现Ⅲ波潜伏期、Ⅰ-Ⅴ波间期缩短，听觉通路上神经传导加快，表明Hup A可以提高中枢对声音的加工过程，进而推断这可能与改变轴突脱髓鞘变有关。NF是神经元特有的结构蛋白，特异性分布于神经元的胞体及突起内[10]。NF根据相对分子质量的不同可分为NF68、NF160和NF200 3种，其中NF200在正常情况下只存于轴索中。所以通过加入NF200抗体，进行免疫荧光染色，计数神经纤维的数目；同时为了标注细胞，使用了苯基吲哚进行细胞核免疫染色。为了不出现重复计数，两者叠加处不在神经纤维计数范围内。经过对比，很容易看出：与对照组比，模型组的神经纤维数目明显减少；而D-gal+Hup A组神经纤维数目则减少不明显。模型组和D-gal+Hup A组比较，差异有统计学意义。说明：Hup A对D-gal致衰老的动物神经纤维具有保护作用，可以延缓神经纤维数目的减少，具有延缓衰老的作用。

因此，Hup A对耳蜗神经纤维的保护作用将有益于老年性聋的临床治疗，然而这一结论还有待于进一步的临床数据证实。

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(本文编辑 杨美琴)

试题5.答案：C。视神经炎是常见的视神经疾病，其典型的表现为：好发于年轻女性，单眼发病，起病急，视力下降，伴有球后或眼球转动痛。视力常在病后1周降到最低。眼底视盘充血，边界模糊，视盘可有极少量条状出血，视网膜正常。视神经炎的病程不论治疗与否，病后2周开始视力逐渐好转，1个月后常恢复到病前或略降低；无论视力恢复多少，1～2个月后视盘出现萎缩，萎缩仅限颞侧或者囊括全部。

试题6.答案：B。随着影像技术的发展，OCT在神经眼科的应用越来越受到重视。尽管多种疾病都造成RNFL变薄，但变薄的模式并不相同。有研究发现在线粒体视神经病变的晚期，14484型突变患者的RNFL厚度显著大于11778型突变患者的RNFL厚度，这可能是11778型突变比14484型突变视力预后更差的原因。

试题7.答案：A。Brown综合征表现为眼内收时上转障碍，绝大多数为单眼发病。黄色瘤为双眼发病，好发于近内眦部皮肤。视网膜格子样变性为双眼发病，表现为视网膜变薄区域呈梭形，伴有交叉网格样白线。瘢痕性早产儿视网膜病变为双眼发病，表现为颞侧眼底周边色素沉着及纤维化。

Protective effect of Huperzine A on nerve fibers of presbycusis rats induced byD-galactose

LICong,GUJian,AOHua-fei,RUANQing-wei＊,KONGDe-qiu.

DepartmentofOtorhinolaryngology,NO.3People’sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China

AO Hua-fei, Email:david5882004@126.com

Objective To investigate the protective effect of Huperzine A (Hup A) on the nerve fibers of presbycusis induced byD-galactose (D-gal). Methods A total of 30 Sprague -Dawley male rats were used in the study. Rats were divided into three groups. ①D-gal group (model group): rats were daily subcutaneously injected with 200 mg/kgD-gal for 8 weeks; ②D-gal+Hup A group: rats were received bothD-gal (200 mg/kg)and Hup A (0.1 mg/kg)in the same way; ③Control group: rats were given the same volume of vehicle. β-galactosidase was used to stain senescent cells in the cochlea and immunohistochemistry was used to detect the number of nerve fibers after treatment. Results Model group had the highest density of senescent cells in the cochlea, but no difference was seen between theD-gal+HupA group and the control group. There was statistically significant difference in the number of nerve fibers between the model and theD-gal+Hup A group (P<0.05), but none was seen between theD-gal+Hup A group and the control group. Conclusions Hup A exhibits protective effect on the nerve fibers of presbycusis induced byD-gal. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:177-180)

Huperzine A;D-galactose; Presbycusis; Nerve fibers; Protective effects

上海交通大学医学院附属第三人民医院耳鼻咽喉-头颈外科 上海 201900；＊复旦大学附属华东医院中心实验室 上海 200040

敖华飞(Email：david5882004@126.com)

2013-08-19)