先天性非综合征性耳聋患者100例常见耳聋基因分析△

许军 叶小磊 陈淑飞 郑周数 邵小飞 苏仁杰 张磊 曾云 史波宁

·临床研究·

先天性非综合征性耳聋患者100例常见耳聋基因分析△

许军 叶小磊＊陈淑飞＊＊郑周数＊＊邵小飞＊＊苏仁杰＊＊张磊＊＊＊曾云＊＊＊史波宁＊＊

目的 应用耳聋基因芯片对先天性非综合征性耳聋(NSHI)患者进行基因筛查。方法 采集宁波市儿童听力筛查诊断中心确诊的100例先天性NSHI患者的外周血，提取DNA。应用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱多态性分型技术检测缝隙连接蛋白β2(GJB2)、GJB3、SLC26A4、线粒体DNA (mtDNA)、12S rRNA热点突变位点。结果 共检出GJB2基因突变22例(22%)、SLC26A4基因突变12例(12%)；未检出GJB3基因和线粒体12S rRNA突变。结论 本组耳聋人群中与筛查位点有关的耳聋比例高达34%，该人群遗传性聋GJB2突变的发生率最高，SLC26A4突变的发生率次之。(中国眼耳鼻喉科杂志，2014，14：184-186)

耳聋； 基因诊断； 缝隙连接蛋白β2； SLC26A4

耳聋是最常见的感觉障碍性疾病，我国听力言语残疾人口已达到2 000余万，居各种残疾之首。新生儿极重度聋的发病率为0.1%～0.3%[1]。耳聋病因复杂，是多种因素共同作用的结果，约60%的先天性耳聋与遗传因素有关[1-2]。世界上迄今已经确定与非综合征性耳聋(nonsyndromic hearing impairment，NSHI)有关的常染色体致病基因超过64个，突变位点125个[3]，近来还不断有新发现。这些都是目前开展遗传咨询、产前诊断以及将来基因治疗的依据。先天性耳聋基因组织库是进行耳聋相关基因诊断的基础工作和必备条件，是对先天性耳聋进行基因诊断，基因保存，临床资料采集、保存及统计的平台。

1 资料与方法

1.1 资料 统计来自于宁波市儿童听力筛查诊断中心确诊的先天性NSHI患者，且已收存于本院耳聋基因组织库中的资料。其中男性61例、女性39例；年龄3个月～10岁，平均3.6岁。100例患者中，顺产73例、剖宫产27例；有听力高危因素者共33例，其中早产6例，母亲孕期患风疹3例、麻疹2例、肾盂肾炎1例、感冒发热用药(具体用药不详)18例，祖辈中近亲结婚1例，家族中有聋哑患者1例，母亲因庆大霉素致聋1例。

1.2 方法

1.2.1 病史采集 采用问卷调查形式，填写患者基本信息及耳聋史、家族史、高危因素等。本研究的临床信息和血样采集均获得了患者监护人的同意，并签署了知情同意书。

1.2.2 听力学诊断 听力学检查包括听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)、听性稳态反应(auditory steady state response，ASSR)、声导抗、纯音测听(仅对较大年龄且能配合者施行)。仪器采用美国GSI 70听力筛查仪及美国智听脑干诱发电位测试系统。每例患者均行耳鼻咽喉科常规检查，在排除外耳、中耳、内耳疾病及噪声性聋的情况下，听力损害以ABR阈值>30 dB nHL为标准。

1.2.3 基因检测方法 采集患者静脉血8 mL，取0.5 mL制作干燥血片，送华大基因深圳华大临床检验中心，使用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS)多态性分型技术，针对缝隙连接蛋白β2(gap junction protein beta-2，GJB2)、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA等4个常见耳聋相关基因中的20个中国人突变热点进行检测[4-5]。其余血液应用全血基因组D.A提取试剂盒提取基因组D.A。微量紫外分光光度计进行定量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪照射条件下观察带纹，确认基因组D.A 质量。分装工作液、标记，置于-80 ℃长期保存备用。

1.2.4 资料整理及保存 将知情同意书、问卷调查表、听力检查结果、绘制的家系图谱、血液样本、基因组D.A样品输入计算机，建立唯一流水号的Excel文件，实现档案的数据化管理，可以随时查看、调用。同时，建立与电子版相对应的纸质档案。以上各资料均以相应的代码保存，保证所有资料一一对应，并由专门人员负责，实现数据化管理。

2 结果

根据病史和听力学检测结果，调查对象均被诊断为先天性聋，其中双侧耳聋93例、单侧耳聋7例；轻中度听力损失45耳、重度及重度以上听力损失148耳。

100例患者基因检测结果见表1。其中检测出GJB2基因致病突变22例，3例患者同时有2个基因检测位点突变,1例为176～191del 16合并235del C，2例为299～300del AT合并235del C；SLC26A4基因致病突变12例，均由CT及磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)扫描证实为大前庭导水管综合征(large vestibular aqueduct syndrome,LVAS)，其中2例患者同时有2个基因检测位点突变，1例为IVS15+5G→A合并1174A→T，1例为1975G→C合并2168A→G。所有检测阳性病例均为双侧耳聋。

GJB2基因突变病例听力损失包括中重度以下12例、重度及以上10例；SLC26A4基因突变病例的听力损失包括中重度以下6例、重度及以上6例。经卡方检验，差异无统计学意义(χ2=0.064,P=0.800>0.05)。

表1 100例耳聋患者4个基因20个位点检测结果(n)

3 讨论

遗传性耳聋致病基因诊断的传统方法主要有酶切法和直接测序，耗时费力、成本较高，且难以同时检测多个基因的不同突变位点。MALDI-TOFMS作为一种高通量的单核苷酸多态性分型技术受到关注，该技术利用过量的低相对分子质量有机酸作为基质吸收激光能量, 再将能量传给被分析的样本, 基质-样本之间发生电荷转移使样本气化、离子化, 从而形成单个负离子或正离子；离子在电场作用下, 飞过自由漂移区到达质谱仪,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即质谱仪根据样本的质荷比(m/z)检测离子，并测得样品的相对分子质量[6]。该技术的特点是，一次可以读取分析最多几百万条DNA序列，相对成本较低，节省时间，具有快速、高准确性、高通量、高度并行性等优点，因此成为临床上耳聋基因检测的重要手段。运用此项技术一次可检测涉及耳聋的20个位点。

对于最常见的GJB2基因突变导致的耳聋，绝大多数表现为先天性重度感音神经性聋，属于NSHI。在不同种族和地域的NSHI患者中，GJB2基因的突变频率和热点突变明显不同。在欧美的高加索人种中，35delG占所有突变的58%～88% ，北欧的犹太人种中167delT为主要突变，占40%；在日本和韩国，235delC为GJB2基因的主要突变[7]。陈俞等[8]发现，235delC是汉族、维吾尔族、回族耳聋患者的热点突变；郭玉芬等[9]报道的801例中国西北地区NSHI患者中，GJB2基因的突变占15.61%(125/801)。本研究100例宁波地区NSHI患者中，235delC 占所有突变的80%(20/25)，其次为299～300delAT，占所有突变的16% (4/25)；而176～191del 16 仅占4% (1/25) ；35delG、167delT在本次研究中没有被检测到。Dai等[10]报道的2 063例NSHI患者中GJB2基因突变432例，本研究所得数据与之比较，差异无统计学意义(χ2=1.621 2,P=0.276)，其报道中主要为235delC突变(345例)，与本组数据比较差异亦无统计学意义(χ2=0.064 6,P=0.799)。

GJB2的基因突变可能导致连接蛋白异常，进而影响细胞间隙的连接功能。引起听力损害的程度多与基因突变类型和位点有关,其中235delC突变为截断型突变,多伴有极重度聋[11]。GJB2基因突变者一般不伴有其他神经系统疾病，耳蜗神经、听觉中枢和螺旋神经节细胞基本正常。此类患儿接受人工耳蜗植入的听力言语康复效果较好，可作为人工耳蜗手术前疗效预测的一项基因检测方法[12]。

LVAS又称先天性前庭水管扩大，其遗传方式为常染色体隐性遗传, 但也可能存在小部分常染色体显性遗传或多分子遗传,与SLC26A4基因突变有关[13]。目前已经报道的SLC26A4基因突变位点超过170个[14], 其中绝大部分是错义突变。另外还有框移突变和剪接位点突变, 可同时存在2个或2个以上的突变位点。LVAS是以前庭水管扩大伴有婴儿期或年幼时波动性、进行性听力损害为临床特征的独立病症, 多表现为NSHI,听力受损以高频为主, 耳聋的程度与前庭水管的大小无关，诊断主要依靠颞骨CT和MRI扫描。常因上呼吸道感染发热、头部撞击、剧烈运动及极度疲劳等，引起颅内压增高而导致耳聋的进一步恶化。目前尚无确切有效的治疗方法, 但应预防听力的骤然下降。部分患者出生时可以无明显听力障碍[15-16]，新生儿大规模的CT扫描在预防医学中是难以实现的,并且家长多因对放射线的顾虑而放弃, 而快速简便的基因检测则有可能在婴儿出生后就发现大部分此类患儿,从而采取严格的防护措施,以尽量保证患儿在言语形成期具备有效听力。本组有LVAS患者14例，均为双耳发病，其中12例检测得SLC26A4基因的突变，占85.7%，1例检测得GJB2基因235del C位点突变，1例检测未见异常，但其母亲孕期有感冒发热用药病史。提示除SLC26A4 基因外，可能还存在与LVAS 发病相关的其他基因或未知的SLC26A4 基因突变位点。

同样的耳聋表型可能由不同的基因突变所致，而同一基因不同位点的突变也可能表现不同的表型，并且遗传性聋可能源于多基因、多突变的累积效应。由于受检测基因数目所限，以及已知遗传学知识的局限性，目前基因检测为阴性者，并不表示没有其他基因问题。先天性耳聋的遗传学研究正在不断深入，不断有新的耳聋致病基因及其突变位点被发现，所以对先天性耳聋患者的D.A，以建立基因组织库的形式保存，供长期研究非常必要。

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(本文编辑 杨美琴)

Deafness gene analysis of 100 patients with congenital nonsyndromic hearing impairment

XUJun,YEXiao-lei＊,CHENShu-fei＊＊,ZHENGZhou-shu＊＊,SHAOXiao-fei＊＊,SURen-jie＊＊,ZHANGLei＊＊＊,ZENGYun＊＊＊,SHIBo-ning＊＊.

DepartmentofOtorhinolaryngology,theaffiliatedHospitalofNingboUniversityMedicineCollege,Ningbo315020,China

SHI Bo-ning, Email:shibn@163.com

Objective To screen deafness gene in congenital nonsyndromic hearing impairment (NSHI) patients with Matrix-assisted laser desorption or ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Methods One hundred patients with congental nonsyndromic sensorineural hearing loss admitted to the children hearing screening and diagnostic center of Ningbo were enrolled in this study. Their peripheral blood samples were taken and tested using MALDI-TOF-MS. Hot mutation sites of four genes including gap junction protein beta-2 (GJB2), GJB3,SLA26A4 and mitochondrial 12S rRNA were detected. Results The positive rate of GJB2 was 22%(22 cases)and of SLA26A4 was 12%(12 cases). Cases with GJB3 or mitochondrial 12S rRNA mutation were not found. Conclusions In this study ,the total positive rate of four genes was 34%.The positive rate of GJB2 was the largest in four genes and SLA26A4 was the second. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:184-186)

Deafness; Genetic diagnosis; Gap junction protein beta-2; SLC26A4

2011年宁波市社会发展科研资助项目(2011C50036)

宁波大学医学院附属医院耳鼻咽喉科 宁波 315020；＊浙江省宁波市分子诊断中心 宁波 315020；＊＊浙江省宁波市儿童听力筛查 诊断中心 宁波市听觉和平衡医学重点实验室 宁波 315020；＊＊＊广东省深圳市华大临床检验中心 深圳 518000

史波宁(Email：shibn@163.com)

2013-05-06)