参姜锁阳益气片对寒凝气滞血瘀证大鼠脑细胞凋亡相关蛋白的影响

贾丹兵，刘 珊，李乃民，唐立明，李春杰，于 淼，巩沅鑫，魏 博

参姜锁阳益气片是由西洋参、桂枝、红花、干姜、锁阳等组成的中药制剂，具有温热祛寒，通经活络，益肺补肾，调炅散瘀之功效。该药物制备工艺稳定［1-2］，质量标准可靠［3］。本研究观察参姜锁阳益气片对寒凝气滞血瘀证大鼠海马区和下丘脑细胞凋亡相关蛋白bax、bcl-2和capase-3表达的影响，探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠48只，雄性，体重(200±20)g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供［许可证号:SCXK(黑)2008004］。常规条件下适应性饲养1周后开始实验。

1.2 实验仪器及药品

1.2.1 主要仪器:电子天平(上海梅德勒公司)，电热恒温箱(上海一恒)，2135型组织切片机(德国徕卡)，医用微波炉(日本松下)，Moticam 3000显微摄影成像系统(美国Motic)，Motic Med 6.0病理图像分析系统(美国Motic)。

1.2.2 主要药品与试剂:参姜锁阳益气片(规格:350 mg，由解放军211医院提供，批号:20100702)，大株红景天胶囊(规格:0.38 g，江苏康缘药业，批号:081108)，盐酸肾上腺素(天津金耀批号:1007121)，水合氯醛(天津科密欧)。兔抗bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗体(武汉博士德)，PV6001两步法二抗、DAB显色剂(北京中杉)，其他为国产分析纯产品。

1.3 动物分组与模型制备 随机选取8只正常大鼠为A组，其余40只大鼠采用肾上腺素加冰水浴复合低温冷冻法［4］，建立寒凝气滞血瘀证大鼠动物模型。方法如下:大鼠禁水12 h，第1天，先采用皮下注射0.1%盐酸肾上腺素0.8 ml/kg，共注射2次，间隔4 h，第1次注射给药后2 h将大鼠置4℃冰水浸泡5 min。于第2天将大鼠分别放入低温冷柜小鼠笼中，在-20℃的冷环境中持续受冻4 h左右。待大鼠出现寒战，畏寒喜暖，蜷缩少动，朦胧欲睡，眼中无神，反应迟钝，呼吸微弱，皮毛蓬松树立无光泽，小便色淡，大便湿烂，唇周发黑，耳色暗红，爪尾部紫暗，舌暗红等症状和体征时将大鼠取出冷柜。每日9:00～13:00冷冻1次，连续冷冻7次。将造模成功的40只大鼠随机分为B、C、D、E、F组，每组8只，各组在末次造模后1 h灌胃给药，每天1次，连续给药2周，给药剂量按成人每日每公斤体重用量进行折算如下:C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg;A、B组均给予等体积生理盐水。

1.4 bcl-2、bax和capase-3表达检测

1.4.1 标本采集方法:各组大鼠应用戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至升主动脉根部，在右心耳剪开一小口做出口。4℃生理盐水200 ml快速灌注，之后稍减慢灌注速度冲洗至流出液清亮，断头后快速于冰盘上取出全脑，放入4%多聚甲醛溶液中固定，分别取海马与下丘脑组织，常规石蜡包埋，切片厚5μm，用于免疫组化染色。

1.4.2 免疫组化PV二步法:切片常规脱蜡到水，3%过氧化氢溶液(H2O2)孵育10 min，PBS冲洗2 min 3次，微波修复:切片入枸橼酸盐缓冲液(pH=6)，微波炉中5 min 2次，间隔10 min。冷却至室温，滴加一抗，4℃冰箱中过夜，PBS冲洗2 min 3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗2 min 3次，DAB显色5～10 min。蒸馏水充分冲洗，苏木素复染1 min，常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4.3 分析方法:采用Motic Med 6.0病理图像分析系统，对免疫组化染色切片进行分析。在400倍镜下每个切片观察4个高倍视野，经显微镜摄像仪摄入，按512×512像素分布，并保存在病理图像分析系统内，用免疫组化分析模块进行分析，先进行分割，选择点状分割将阳性物标记为棕黄色，除去非特异染色，计算出阳性细胞表达数目，取其平均值，进行统计学处理。

1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 免疫组化 大鼠海马区和下丘脑神经元细胞的阳性表达在胞质中呈现黄色或棕黄色，颜色由深到浅，以神经元细胞质中表达最明显，见图1～6。

2.2 凋亡相关蛋白表达 与A组比较，B组海马区和下丘脑bcl-2阳性细胞数明显降低，bax和capase-3阳性细胞数明显增加(P＜0.01);与B组比较，除C组下丘脑bcl-2外，C、D、E、F组海马区和下丘脑bcl-2阳性细胞不同程度升高，而bax和capase-3阳性细胞数均有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01);与F组比较，C、D、E组海马区的bax阳性细胞数升高(P＜0.05，P＜0.01)，海马区 bcl-2、caspase-3和下丘脑区bcl-2、bax、caspase-3阳性细胞数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

3 讨论

《内经》中记载:“肺朝百脉，输精于皮毛，本末之寒温相守司也，是谓平人。寒气入经而稽留，寒独留则血凝泣，血凝泣则脉不通。”现代研究表明，寒冷刺激首先使身体浅表的微动脉及小动脉收缩，表层血流减少，皮肤因之变为苍白色。同时动静脉吻合支开放增多，血液向静脉回流加快，导致局部组织缺血缺氧，甚至坏死。寒冷刺激引起微循环障碍，血液黏度增高，血栓凝集导致血流瘀塞。我们采用肾上腺素加冰水浴复合低温冷冻法制备寒凝气滞血瘀证动物模型，更能接近机体在高寒缺氧环境下的病理过程，符合中医证候特点，也与现代医学的观点相一致，且该模型具有操作方法简单，模型稳定性好等优点。

细胞凋亡也称程序性细胞死亡，是细胞接受生理或病理信号刺激后启动的一种主动消亡过程，是保持组织细胞自稳态的一个基本过程，但过度凋亡则导致组织损伤，进而引起功能障碍［5］。细胞凋亡的调控机制是多方面的，其中细胞因子和bcl-2家族等对细胞凋亡有重要的调控作用。有研究表明细胞凋亡是多基因控制的细胞主动死亡过程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的协同控制。bcl-2和bax作为一对关系密切的凋亡相关基因，在中枢神经系统中均有表达，在神经细胞凋亡的控制中起重要作用［6］。bcl-2基因有促进细胞周期和细胞增殖的能力，其过度表达可特异性抑制细胞凋亡。bax基因的过度表达能加速白介素3(IL-3)细胞株在细胞因子缺失时发生细胞凋亡，并对抗bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，从而促进细胞凋亡［7］。即bcl-2大量表达时，形成bcl-2同源二聚体，凋亡受到抑制;bax大量表达时，则形成 bax同源二聚体，细胞趋向凋亡［8］。Lu等［9］研究大鼠闭合性脑损伤后中枢神经系统神经元凋亡的时程，在4 h bax蛋白表达增高，并伴随着bcl-2表达下调，在伤后l d处死的大鼠海马区发现不同数量的TUNEL阳性细胞。彭申明等［10］研究显示，雌激素和菟丝子总黄酮可抑制痴呆小鼠海马区神经细胞凋亡率，可使抗凋亡蛋白bcl-2表达显著升高，同时也明显抑制痴呆小鼠促凋亡蛋白bax、caspase-3的表达，显示其良好的抑制神经细胞凋亡的作用。

表1 6组大鼠海马及下丘脑组织中细胞凋亡相关蛋白表达(x ± s，n=8)

图1 6组大鼠海马区bcl-2蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

图2 6组大鼠海马区bax蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

图3 6组大鼠海马区caspase-3蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

图4 6组大鼠下丘脑bcl-2蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

图5 6组大鼠下丘脑bax蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

图6 6组大鼠下丘脑caspase-3蛋白的表达(PV×400)A组为正常对照组，仅给予等体积的生理盐水;B组为模型组，给予等体积的生理盐水;C、D、E组分别给予参姜锁阳益气片70、140、280 mg/kg;F组给予大株红景天胶囊280 mg/kg

caspase即半胱氨酞天冬氨酸特异性蛋白酶，是特异的凋亡信号转导分子，激活后的caspase是凋亡执行者，caspase的超表达和激活均引起细胞凋亡，因此又称“死亡蛋白酶”。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其以不活跃的形式或酶原的形式存在于细胞中，其活性位点均含有半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”的序列，酶原活化时将原结构域切除，同时分成小片段(12kDa)和(17kDa)两个亚型才能有效。其表达上调表明凋亡通路被激活，细胞死亡增加［11］。郁志华等［12］研究发现疲劳结合中、大剂量普萘洛尔在造成大鼠心气虚证模型的基础上，其脑内皮层和海马部位 bcl-2 mRNA表达明显降低、海马 caspase-3 mRNA表达明显升高，说明其脑内皮层和海马部位的神经细胞出现凋亡。李巾伟等［13］研究显示，三七总皂甙能促进脑出血大鼠前脑内抑凋亡基因bcl-2 mRNA的转录和bcl-2蛋白的表达，抑制促凋亡基因capase-3 mRNA的转录及capase-3蛋白的裂解活化，减少细胞凋亡。

本研究采用的参姜锁阳益气片方中以西洋参、干姜、桂枝、白术为君药，提高人体正气，宣通血分，增强人体脏腑皮毛抗寒御寒能力;以麦冬、远志、补骨脂、淫羊藿、枸杞子、巴戟天为臣药，益肺，补肾，强心，护脑，固护命门，提高血管壁的感受器和促心肌收缩物质(儿茶酚胺)的功能、增强心脑排血量，使大动脉至小动脉毛细血管扩张功能增强，提高人体整体抗御高寒能力，抗御寒邪直伤五脏;红花、当归、阿胶、锁阳为佐药，与人体脏腑皮毛之四末，抗寒，御寒，耐寒，增加人体毛细血管壁通透载体，提高囊泡饱吐功能，建立毛细血管前括约肌，真毛细血管网捷径运输，使炅气与滞血相通于脉中，致脉络阻塞疏通至脏腑四末，使血之气之诸迅速得以改善;以鹿茸、荜拔为使药，使上述信息速达于机体各处，快速改善由于高寒所造成的脏腑四末血滞，缺氧，功能减退，疲劳等症候，达到阳中益阴，以整体统局部，使君臣佐使诸药融为一体，发挥其祛寒益气之功效。

本研究结果表明，与A组比较，B组海马区和下丘脑bcl-2阳性细胞数明显降低，bax和capase-3阳性细胞数明显增加，我们既往的研究显示，寒凝气滞血瘀症大鼠抗氧化系统功能也明显降低［14］。提示在寒冷应激下，大鼠抗氧化清除自由基的功能减弱，导致血脑屏障通透性增加，脑组织水肿，从而引起神经细胞发生凋亡。与B组比较，C、D、E组海马区和D、E组下丘脑bcl-2阳性细胞不同程度升高，而bax和capase-3阳性细胞数均有不同程度的降低。提示参姜锁阳益气片可能通过调节机体抗氧化系统功能，抑制神经细胞凋亡途径而起到脑保护作用。

红景天含有红景天苷、酪醇、黄酮、多种微量元素、氨基酸、维生素A、C、D、E和超氧化物歧化酶等，具有益气、活血、通脉等功效［15］。红景天的免疫调节功效已被许多药理实验所证实［16-17］。大株红景天胶囊主要成分红景天苷、红景天素及茎叶提取物，具有活血化瘀，通脉止痛的功效。有文献报道，红景天制剂可以降低人体全血黏度、血浆黏度，减少血小板聚集，改善血液流变学及血脂情况，可降低人体氧耗量，提高氧利用率［17-19］。本研究结果显示，与B组比较，F组海马区和下丘脑bcl-2阳性细胞不同程度升高，而bax和capase-3阳性细胞数均有不同程度的降低，而C、D、E组海马区bax阳性细胞数较F组升高，提示红景天对寒冷刺激引起的微循环障碍，局部组织缺血缺氧具有较好的疗效。

综上所述，参姜锁阳益气片可以影响脑组织中细胞凋亡相关蛋白表达，具有抗神经细胞凋亡的作用，从而起到脑保护作用。

［1］ 刘珊，贾丹兵，李乃民，等.正交试验法优选参姜锁阳益气片的提取工艺［J］.中国药师，2011，14(9):1270-1272.

［2］ 贾丹兵，刘珊，李乃民，等.参姜锁阳益气片成型工艺的研究［J］.中国医药导报，2012，9(29):129-130.

［3］ 贾丹兵，刘珊，李乃民，等.参姜锁阳益气片的质量控制［J］.中国医院药学杂志，2011，31(11):940-942.

［4］ 贾丹兵，于淼，李乃民，等.寒凝气滞血瘀证大鼠动物模型的建立及评价［J］.中医药信息，2014，31(4):75-77.

［5］ 蒋鹤飞，武静，陈继婷，等.Bcl-2和Bax在脾阳虚大鼠下丘脑组织中的表达和大建中汤的干预作用［J］.时珍国医国药，2012，23(11):2716-2717.

［6］ Yang B，Prayson R A.Expression of Bax，Bcl-2，and P53 in progressive multifocal leukoencephalopathy［J］.ModPathol，2000，13(10):1115-1120.

［7］ 郑航，郑新民，李世文，等.Bcl-2/Bax基因表达对隐睾生殖细胞凋亡的影响［J］.中国男科学杂志，2000，14(2):81-85.

［8］ 赵慧英，龙敏，徐永平，等.雌激素和IFN-γ对去卵巢大鼠下丘脑中Bcl-2和Bax表达的影响［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2011，39(10):58-62.

［9］ Lu J，Moochhala S，Kaur C，et al.Changes in apoptosisrelated protein(P53，Bax，Bcl-2 and Fos) expression with DNA fragmentation in the central nervous system in rats after closed head injury［J］.Neurosci Lett，2000，290(2):89-92.

［10］彭申明，陈勤，陈逸青，等.菟丝子总黄酮对内分泌衰退痴呆模型小鼠学习记忆功能的影响及保护作用机制［J］.激光生物学报，2014，23(3):218-226.

［11］曲珍珍，王维平，毛卓锋，等.PTZ诱导孕鼠痫性发作对胎鼠海马中 bax、bcl-2、capase-3 表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2012，29(10):883-885.

［12］郁志华，林水淼，陈久林.心气虚证模型大鼠脑内细胞凋亡相关基因的变化研究［J］.中华中医药学刊，2010，28(2):339-341.

［13］李巾伟，朱培纯，司银楚，等.三七总皂苷对脑出血大鼠前脑促凋亡基因capase-3影响的研究［J］.北京中医药大学学报，2003，26(2):22.

［14］贾丹兵，于淼，李乃民，等.参姜锁阳益气片对寒凝气滞血瘀证大鼠血清中6-keto-PGF1a、TXB2及氧自由基代谢的影响［J］.中医药学报，2014，42(3):26-28.

［15］国家药典委员会.中华人民共和国药典［K］.北京:化学工业出版社，2010:144.

［16］包文芳，李欣.四种国产红景天中红景天甙的含量分析［J］.沈阳药科大学学报，1995，12(4):263.

［17］ 金萍.红景天的研究现状［J］.光明中医，2011，26(7):1508-1511.

［18］吴泽铭，刘银蓉，张大创，等.大株红景天胶囊治疗慢性脑供血不足的临床研究［J］.辽宁中医药大学学报，2007，9(3):126-127.

［19］龙继红.红景天属植物药用研究进展［J］.中国药品标准，2007，8(1):11-14.