CYP2C9及VKORC1基因多态性对心脏瓣膜置换术后华法林个体剂量差异的研究

彭 齐，陈晓英，宋 杰

华法林是目前临床最常用的口服抗凝药物，但其用药剂量在不同种族间及个体间存在较大差异，甚至可相差10～20倍［1-2］。即使使用相同抗凝剂量，不同个体发生出血或血栓事件概率也不同，这与个体差异有关。近年研究显示，细胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1基因(VKORC1)多态性是造成个体间华法林维持剂量差异的主要原因［3-4］。本文旨在研究湖北地区汉族人群中CYP2C9和VKORC1基因多态性分布特点及基因变异位点对华法林稳态剂量的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2012年3—8月在武汉亚洲心脏病医院心脏外科行心瓣膜置换术患者108例为华法林组，入选标准为:汉族、＞18岁、稳定华法林抗凝至少3个月、国际标准化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除标准:肝、肾及甲状腺功能异常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及维生素K等影响INR的药物。所有入选对象均来自湖北省各地区就诊的汉族居民，相互间无血缘关系及异族通婚史。选择同期健康受试者85名为对照组。华法林组男50例，女58例，年龄(50.51±13.10)岁;对照组男39例，女46例，年龄(48.78±12.82)岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:收集入选受试者的静脉血(枸橼酸钠抗凝)3 ml用于检测 INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同时观察患者年龄、性别、体重、身高及华法林稳态剂量。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1 总DNA提取:采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取样本的血液基因组DNA，1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测总基因组条带。

1.2.2.2 目的片段的PCR扩增:引物由大连宝生物公司合成(表1)，采用50μl的反应体系进行扩增(表2)，反应条件:94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，50 ～65℃退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，共 30个循环，72℃保温10 min。PCR反应在 ABI 9700 PCR仪上进行，采用2.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，得到预期大小的片段后，采用百泰克PCR产物回收试剂盒对目的片段进行纯化回收。

1.2.2.3 目的片段的测序反应:对目的片段进行测序PCR反应后，并对测序PCR产物进行纯化。最后把目的片段上机测序并读取结果(图1～3)，测序仪为ABI 3500基因分析仪。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，Pearsonχ2检验用于检查基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，Spearman等级相关用于分析华法林剂量与年龄、身高、体重以及INR值的关系，CYP2C9、VKORC1基因型之间华法林稳态剂量的比较使用两样本t检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 基因型分布 两组中基因型分布与华法林国际药理学联盟(IWPC)提供的临床和遗传学数据相符［1］。两组CYP2C9和VKORC1基因型频率和等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3～4。

2.2 不同基因型患者临床资料及华法林稳态剂量的比较 108例CYP2C9和VKORC1基因型临床资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但CYP2C9基因*1/* 3型较*1/*1型华法林稳态剂量小，VKORC1基因AA型较GA型华法林稳态剂量小(P＜0.05，P ＜0.01)，VKORC1基因型 GG 型仅 3例，未做比较，见表5。

表1 扩增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的上下游引物

表2 扩增VKORC1-1639G＞A、CYP2C9*2和CYP2C9*3目的片段的反应体系

图1 VKORC1-1639G＞A测序结果

2.3 基因序列 37例较长时间达到目标INR且稳态剂量不太稳定的患者基因非检测位点突变很多，见图4。CYP2C9基因变异位点非常多的患者和大多数人的基因图谱见图5～6。

2.4 非典型突变氨基酸表达情况 除了检测的3个多态位点，还发现了50余个变异位点，在这些变异中有14种变异引起了氨基酸表达的变化。这些非典型变异中有一些文献报道的如 rs28371686、rs28371685、rs5750570等。无文献报道的有8种，包括CYP2C9*2 Ile 177 Leu(A→C)55例(50.9%，MAF 25.5%)，CYP2C9*3 His 353 Asp(C→G)5例(4.63%，MAF 2.31%)，VKORC1-1691(T＞G)1例(0.93%，MAF 0.46%)，其中CYP2C9*3 His 353 Asp的变异可能对蛋白质的活性影响比较大，因为组氨酸(His)为酸性带正电荷，天冬氨酸(Asp)为碱性带负电荷，两种氨基酸性质相差太大。现检测华法林用量的3个基因位点，其MAF分别为8%、4.2%和＜0.1%。我们发现的上述3个位点的MAF已经和这通用的3个位点相当。

图2 CYP2C9*2测序结果

图3 CYP2C9*3测序结果

表3 两组CYP2C9基因型频率和等位基因频率分布［例(%)］

表4 两组VKORC1基因型频率和等位基因频率分布［例(%)］

表5 CYP2C9和VKORC1不同基因型患者临床资料及华法林稳态剂量的比较(x±s)

图4 两批样本基因序列比较非黑色部分表示此位点有样本突变;a.稳态剂量稳定样本;b.稳态剂量不稳定样本

图5 CYP2C9*3基因变异位点多的患者基因图谱

图6 多数人CYP2C9基因图谱

3 讨论

影响华法林剂量的因素主要有遗传因素以及身高、体重、年龄、性别、种族、药物相互作用等。华法林IWPC发表的研究显示，加入药物基因组学的预测模型(包括基因型)比临床预测模型(不包括基因型)准确性提高了80%［1］。所以个体的遗传特征对于华法林的剂量影响很大［2-4］。目前研究发现与华法林药效学和药动学相关的基因达30多种，其中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因［5-6］。美国FDA在华法林用药说明书中介绍了 CYP2C9和VKORC1基因对剂量的影响并建议在用药之前做基因检测。

CYP2C9是人类肝脏中一种重要的由CYP超基因家族编码的药物代谢酶系统。CYP2C9是CYP2C亚家族中的一种同工酶，约占肝微粒体中CYP总量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位点，研究较多的也最常见的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中国人群中CYP2C9*3变异位点相对更多［6-7］，主要是第359位的氨基酸由异亮氨酸变成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突变携带者华法林剂量需求较野生型患者低，且CYP2C9*3携带者出血风险较高［5］。VKORC1基因位于16号染色体，此蛋白质为组成维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位之一，主导维生素K依赖性凝血因子的生成，是华法林的作用靶点。VKORC1基因启动子区-1639G＞A多态性与华法林临床用药剂量相关，AA基因型华法林剂量需求较AG和GG型低。在中国患者中三者的频率分别是79.7%、17.6%和2.7%。

本研究探讨了湖北地区汉族人群中这两种基因型的分布、不同基因型患者需要的华法林稳态剂量比较以及年龄、身高、体重与华法林稳定剂量的关系。在湖北地区汉族人群中，存在 CYP2C9和VKORC1基因多态性，且不同基因型患者间华法林用量存在差异，CYP2C9*1/*3型较*1/*1型华法林需求量少，考虑突变型的CYP2C9酶(中国人群中主要为*1/*3)与野生型(*1/*1)酶相比，对华法林的代谢能力下降，导致患者对华法林治疗敏感，故所需剂量减少［8-9］;VKORC1 AA型较GA型华法林需求量少，VKORC1启动子的基因多态性是影响华法林稳态剂量种族差异和个体差异的主要因素，华法林敏感者的基因型为纯合子AA，而华法林抵抗者则为基因型 GA或者 GG，进一步说明CYP2C9和VKORC1的基因多态性是造成个体间华法林稳态剂量差异的主要原因［10］。

以往众多研究已表明，影响华法林剂量的因素主要有遗传因素以及身高、体重、年龄、性别、种族、药物相互作用等［11-12］。我们将在以后的研究中进一步关注和探讨此问题。鉴于CYP2C9和VKORC1的不同基因型华法林用量存在明显差异，本中心目前对临床需口服华法林的患者进行基因型检测，并根据基因分型指导华法林初始剂量的选择，希望能借此减少患者反复抽血检测，以及降低抗凝出血的风险［13-14］。

本研究中37例INR维持量不太稳定的患者，非检测位点突变很多，提示除目前3个位点外仍有其他位点变异因素，如果其中任何一个被证明和华法林用药相关，都会是一个重要的发现，对临床用药、科学研究都会有较大的影响。目前需要更多的样本、数据给予支持。近年来，随着研究的深入，针对国人华法林剂量构建的预测模型已越来越多，且纳入了遗传因素，可解释约40% ～74%的个体剂量差异［15］。但是，目前基于中国人群构建的剂量预测模型存在样本量较小、纳入的影响因素少，以及缺少外部验证等弊端。因此，我们需要更大样本量的研究，对已构建的模型进行验证或是构建新模型。我们也需要纳入更多的遗传和非遗传因素，以期提高对华法林个体差异的解释百分比。

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