褐藻多糖硫酸酯在小鼠N2a细胞缺血再灌注损伤中的作用

李珊珊，徐志伟，桑文文，王伟英，杨 旭

缺血性脑卒中(ischaemic stroke，IS)是我国致残和致死的主要疾病之一，目前虽然针对IS的治疗方法有很多，但唯一有效的治疗方法就是溶栓疗法，患者受治疗窗和禁忌证的限制使得溶栓的治疗不能广泛应用。氧化应激在IS中起重要作用，NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)最近已被证明在生理条件下是调节氧化应激的重要转录因子［1］。褐藻多糖硫酸酯(fucoidan，FPS)是一种天然来源的海藻多糖，具有多种生物活性，尤其是其抗炎和抗氧化活性近年来受到了学者的广泛关注［2］。罗鼎真等［3］通过大鼠脑缺血再灌注损伤后腹腔内注射FPS检测大鼠神经功能评分和脑梗死的面积，发现FPS对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，但是机制仍不明确。国内外的研究表明，FPS可以抑制活性氧自由基的生成并促进其清除，从而表现出抗氧化活性。我们前期的研究亦发现FPS对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，能够增加Nrf2的表达。故而我们在细胞离体水平上，建立小鼠 N2a细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型，模拟脑缺氧缺血损伤的病理过程，观察FPS对OGD/R引起N2a细胞损伤的保护作用，并进一步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 鼠源性 β-actin抗体(Sigma:A1978)、蛋白酶抑制剂(Roche:4693132001)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗(Gibco，A16066，A16110);ECL发光试剂盒(Gibco，WP20005);BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific，23209);凋亡试剂盒CytoTox 96@非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega，G1780);Bio-MaxMR X-线胶片(Kodak公司)。

1.2 N2a细胞及OGD/R模型制备 小鼠N2a成神经瘤细胞(购自协和细胞中心)，常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖，Gibco公司)完全培养基中，并置入37℃、含21%O2、5%CO2和74%N2常氧混合气体、饱和湿度培养箱内培养，24 h换液，2～3 d传代。将N2a细胞分成对照组、OGD/R模型组、FPS处理组，其中OGD/R模型组细胞使用无糖Earle＇s平衡盐溶液替换正常的细胞培养液，将其置于37℃含体积分数0.95 N2和0.05 CO2的混合气体的培养箱，2 h后换正常培养液，然后正常培养条件继续培养24 h。对照组细胞使用有糖Earle＇s平衡盐溶液正常条件培养2 h后，再换正常培养液正常条件继续培养24 h。FPS处理组在造OGD/R模型前24 h 加入1、2、5、10 μg/ml的PFS 孵育。

1.3 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)测定 各组细胞按实验要求处理后，每孔加入含0.5 g/L MTT细胞培养液150μl培养4 h。弃上清，每孔加 DMSO 150μl，37℃ 振摇孵育15 min，酶标仪490 nm波长检测光密度值，来计算细胞生存率。此值越高代表N2a细胞存活率越高。

1.4 乳酸脱氢酶(LDH)测定 各组细胞按实验要求处理后，收集各组培养液上清，然后使用体积分数0.002 TritonX-100破膜，再次收集各组细胞液体，根据试剂盒说明书分别测得上清和细胞中的LDH活力，计算上清LDH/总LDH值，来确定细胞坏死水平。此值越高代表N2a细胞死亡率越高。

1.5 Western blot检测 提取全细胞蛋白、BCA法定量，-80℃保存备用。每组样品取30μg蛋白进行电泳(10%SDS-PAGE，4℃，20～30 mA)和转膜(PVDF膜，300 mA，2 h)。先后用兔源性抗 HO-1(1∶1000)和鼠源性 β-actin(1∶1000)一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠二抗(1∶5000)进行免疫杂交;然后用ECL发光，X线曝光、显影、定影。所得结果用Gel Doc凝胶成像系统扫描后，对目的蛋白进行定量分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析及SNK-q检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 FPS对抗OGD/R诱导N2a细胞损伤的作用与对照组比较，MTT测定显示OGD/R模型组和不同浓度FPS处理组N2a细胞存活率均显著降低(P＜0.05，P ＜0.01)，当FPS≤5 μg/ml时具有显著性差异(P＜0.01);与OGD/R模型组比较，MTT结果显示 FPS处理组N2a细胞存活率升高，FPS≥5μg/ml时具有显著性差异(P＜0.01)，见表1。与对照组比较，LDH测定显示OGD/R模型组和不同浓度FPS处理组N2a细胞死亡率均显著升高(P＜0.05，P ＜0.01)，当 FPS≤5 μg/ml时具有显著性差异(P＜0.01);与OGD/R模型组相比，LDH检测结果显示 FPS处理组N2a细胞死亡率降低，FPS=10.0μg/ml时具有显著性差异(P＜0.01)，见表1。

表1 FPS对OGD/R小鼠N2a细胞存活率和死亡率的影响(x±s)

2.2 FPS增加Nrf2的核转位 Western blot检测结果显示，OGD/R模型组N2a细胞Nrf2的核转位灰度值为1.20±0.10，较对照组增加(P＜0.05);其不同浓度(1、2、5、10 μg/ml)FPS均能促进 Nrf2的核转移，其灰度值分别为1.63±0.21、2.30±0.20、2.80±0.10、2.90±0.26，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，且在FPS≥2μg/ml时对Nrf2的核转移促进作用较明显(P＜0.01);与OGD/R模型组相比，不同浓度FPS组Nrf2的核转移均增加，FPS≥2μg/ml差异具有显著意义(P ＜0.01)，见图1。

2.3 FPS增加Nrf2下游蛋白血红素加氧酶(HO-1)的表达 Western blot检测结果显示，OGD/R模型组N2a细胞HO-1的表达量为1.13±0.12，但与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);不同浓度(1、2、5、10 μg/ml)FPS 组 HO-1 的表达分别为1.47 ±0.15、2.30 ±0.20、2.47 ±0.15、2.83 ±0.15，均较对照组增加(P＜0.05，P＜0.01)，当 FPS＞2μg/ml时差异具有显著意义(P＜0.01)。与OGD/R模型组比较，FPS各浓度组HO-1的表达均增加(P ＜0.05，P＜0.01)，当 FPS＞2 μg/ml差异具有显著意义(P＜0.01)，见图2。

图1 Western blot检测FPS对OGD/R小鼠N2a细胞核转位的影响 OGD/R:氧糖剥夺/复糖复氧;Nrf2:NF-E2相关因子2;Histon H3:内参照

图2 Western blot检测FPS对OGD/R小鼠N2a细胞Nrf2下游蛋白HO-1表达的影响 OGD/R:氧糖剥夺/复糖复氧;Nrf2:NF-E2相关因子2;HO-1:血红素加氧酶1

3 讨论

N2a细胞是小鼠来源神经瘤母细胞，是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle经A株白鼠的自生肿瘤建立，该细胞贴壁，已在多个实验室培养并成功建立体外氧糖剥夺(OGD)模型［4-5］。OGD模拟体内脑缺血过程是一个良好的并且经典的模型［6-7］，氧化损伤增加的标志物可以在这个模型中观察到［8-9］。

氧化应激是由于各种原因破坏了组织细胞的氧化和抗氧化平衡，致使ROS形成过多或者清除不足而形成的损伤状态。ROS的产生可导致如生物膜结构和功能的改变、损伤DNA导致细胞突变等一系列有害作用。因此，保持体内ROS的平衡对维持正常过程至关重要。近年来，多项研究提示，多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由基等作用，在保护生物膜中发挥着重要作用。其中，FPS作为一种具有生物活性的硫酸化多糖，主要存在于藻类和棘皮动物中，具有显著的体外抗氧化活性，对-OH、O2-具有良好的清除作用，可降低血清中过氧化脂质含量，同时显著提高组织中超氧化物歧化酶的含量。范莹等［10］研究表明Fu可以降低大鼠的神经功能评分，缩小大脑梗死体积;并在SH-SY5Y细胞上验证了Fu可以减轻缺糖缺氧对细胞的毒性作用，并降低细胞的凋亡率，但是其机制尚不清楚。本研究结果发现，在N2a细胞OGD/R模型中应用FPS可显著提高细胞存活率，并呈浓度依赖性。本研究亦发现，FPS也可浓度依赖性抑制OGD/R诱导LDH的释放。结果提示，FPS可以增强细胞的活力、减少细胞的凋亡，减轻OGD/R对细胞的损伤。

Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子。在正常情况下，Nrf2在细胞质与Keap1蛋白结合处于非活性状态。氧化应激时，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核内与抗氧化反应元件结合，启动下游靶基因HO-1和其他抗氧化酶如NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及谷胱甘肽S-转移酶(GST)等［11-13］，从而发挥抗氧化作用［14］;这些作用已经在脑缺血损伤中证实过［15-18］。既往研究表明，激活Nrf2信号通路继而上调其下游靶蛋白的表达，可以对缺血性脑卒中起到保护作用。Tanaka等［19］的研究发现，MCAO 后再灌注，2 h后Nrf2表达增加并在8 h达到高峰;其下游抗氧化蛋白Trxs、GSH以及HO-1在24～72 h梗死区域的表达亦显著升高。大鼠MCAO模型中，侧脑室或腹腔内注射tBHQ均可降低运动感觉缺损和缺血后的梗死面积［20-21］。与此项研究类似，Nrf2敲除小鼠MCAO后90 min进行再灌注，其神经功能缺损恶化并伴有梗死面积增加［22］。此外，Nrf2基因敲除小鼠的pMCAO模型中，其损伤后7 d的恢复情况亦显著降低［20］。故活化Nrf2信号通路对缺血性脑卒中后的损伤具有保护作用。在本研究中，我们应用Western blot法检测了各组细胞胞浆和胞核内Nrf2的表达情况，发现N2a细胞OGD/R后Nrf2及其下游靶蛋白HO-1表达均增加，提示氧化损伤后可以激活Nrf2/ARE通路，起到自身抗氧化作用;同时发现FPS能够有效促进Nrf2的核转位，并呈剂量依赖性。因此推测，FPS对脑缺血再灌注的保护作用可能是通过促进Nrf2的表达，降低了脑缺血再灌注时氧化应激的水平。

Nrf2/ARE信号通路可诱导Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶类等多种抗氧化物质的生成。HO-1作为重要的Ⅱ相解毒酶，其通过催化血红素转化为等分子量的胆绿素、一氧化碳和游离铁发挥着强大的抗氧化作用，是反映细胞内抗氧化能力的重要指标。本研究结果提示，不同浓度FPS处理能够促进HO-1的表达，这亦间接提示Nrf2在脑缺血再灌注中发挥着抗氧化应激作用。

综上所述，FPS对OGD/R的N2a细胞有剂量依赖性的抗氧化应激作用，其保护机制可能部分是通过促进Nrf2的表达而实现，但其更加详细的抗氧化应激机制仍需进一步研究。

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