人肝细胞癌组织中叶酸受体和Delta样配体4的表达及分布

王晓辉，惠 玲，罗 芸

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一［1］。我国HCC发病人数占全球的55%，且随着乙型慢性肝炎、肝硬化等肝脏疾病发生率的升高，HCC发病率亦逐年上升［2］。HCC起病隐匿，确诊时往往已是中晚期，加上合并肝硬化等多方面原因，以手术切除为主的综合治疗能够消除HCC局部病灶，但其5年复发、转移率仍然＞50%［3］。随着肿瘤治疗技术的不断发展，分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗等手段已成为HCC治疗的希望。分子靶向治疗针对肿瘤组织中特异性分子靶点，通过干预及调控相关信号传导通路，从而抑制肿瘤生长、发展及转移［4］。本研究采用免疫组化及Western blot方法检测叶酸受体(FR)和Delta样配体4(Dll4)在HCC组织及正常肝组织中的表达及分布特点，探讨FR及Dll4作为HCC分子靶向治疗新靶点的可能性。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器 兔抗人FR、Dll4单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗人β-actin单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP、卵白素-生物素复合物、DAB显色试剂购自北京中杉金桥公司。ECL超敏化学发光液购自武汉博士德公司。2235型石蜡切片机为德国莱卡公司产品，IX-71型活细胞成像工作站为日本Olympus公司产品，ChemiDoc型化学发光成像系统为美国UVP公司产品，Mini-PROTEAN蛋白凝胶电泳系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 组织标本获取 经兰州军区兰州总医院医学伦理学委员会批准，并经患者知情同意后，随机选取我院肝胆外科2013年1—10月根治性手术切除HCC标本24例，术前未经放化疗等治疗，男15例，女9例，年龄(56.35±9.76)岁;9例正常肝组织为同期肝血管瘤旁切除肝组织，男4例，女5例，年龄(48.76±5.18)岁，两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)。所有标本离体后，液氮速冻保存，部分取出于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 HE染色判断组织类型 经多聚甲醛固定的组织梯度乙醇脱水(由低到高)，二甲苯透明，浸蜡包埋。切片机将组织切为5μm薄片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水(由高到低)，苏木素染色15 min。1%盐酸乙醇液分化，漂洗，脱水，0.5%伊红乙醇溶液复染2 min。再经梯度乙醇脱水(由低到高)，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察组织结构。

1.4 免疫组化染色及结果判定 切片脱蜡，梯度乙醇复水，3.0%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，0.01 mol/L枸橼酸钠抗原修复15 min，蒸馏水清洗2次。加入5.0%的BSA封闭液，37℃孵育30 min。分别加入免抗人FR、Dll4单抗，4℃过夜，PBS清洗3次。滴加生物素标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育30 min，PBS清洗3次。滴加SABC试剂，室温孵育30 min，PBS清洗5次。DAB室温显色20 min，苏木素复染，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定:镜下随机观察5个非重叠视野(×400)，根据棕黄色染色阳性细胞所占百分比计分:＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分;阳性细胞染色强度计分:无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，褐色3分。采用强度×百分比判定，＞3分为阳性。

1.5 Western blot检测FR及Dll4的表达 取小块液氮冻存组织，加入300μl RIPA细胞裂解液，低温条件下组织匀浆，冰浴30 min，BCA法蛋白定量。100μg总蛋白行12%SDS-PAGE凝胶电泳，300 mA恒流电转40 min，将蛋白转移至硝酸素纤维膜(NC膜)。将NC膜置于5%脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶500稀释的兔抗人 β-actin、FR、Dll4单抗4℃孵育过夜。加入1∶1000稀释的羊抗兔IgG-HRP二抗，37℃孵育2 h，ECL超敏化学发光液显色，ChemiDoc型化学发光自动成像系统拍照并半定量分析。

1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验;计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 正常肝组织及HCC组织的形态学观察 正常肝组织中，细胞索排列整齐，以中央静脉为中心放射状排列，肝窦正常，细胞呈多边形，边界清楚，胞核结构正常，位于细胞中央，胞质丰富，无明显病变。HCC组织中，肝脏正常结构被肿瘤组织浸润、破坏，细胞巢状排列，体积增大，胞质丰富，呈多角形，细胞核形态多样，大而深染，镜下可见核分裂象，部分区域有假小叶形成或见肝细胞水变性、脂肪变等病毒性肝炎的病变特点，见图1。

图1 正常肝组织及肝细胞癌组织镜下形态(HE×100)A.正常肝组织;B.肝细胞癌组织

2.2 FR及Dll4的表达 FR免疫组化染色结果显示，在24例HCC组织中，22例呈阳性表达，其中强阳性8例，阳性12例，弱阳性2例，广泛表达于肿瘤细胞的细胞膜及胞质中;而在9例正常肝组织中均表现为FR的阴性表达，见图2。Dll4免疫组化染色结果显示，在24例HCC组织中，23例呈阳性表达，其中强阳性15例，阳性6例，弱阳性2例，主要表达在肿瘤血管内皮细胞及周围肿瘤细胞的细胞膜上;而在9例正常肝组织中3例呈弱阳性表达，见图3。HCC组织中FR、Dll4阳性率均高于正常肝组织，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.3 Western blot检测FR和Dll4的表达 提取冰冻组织的总蛋白，Western blot检测正常肝组织及HCC组织中FR和Dll4的表达，并按照公式(目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值×100%)计算FR和Dll4的相对表达量。HCC组织中FR的相对表达量为(118.39±26.59)%，正常肝组织中未见FR的表达;HCC组织中Dll4的相对表达量为(145.81±33.61)%，正常肝组织中 Dll4的相对表达量为(45.18±17.90)%。HCC组织中FR和Dll4的相对表达量均高于正常肝组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步证实了，在HCC组织中FR蛋白特异性表达、Dll4蛋白高表达，而正常肝组织中Dll4蛋白低表达，FR蛋白不表达，见图4。

图2 正常肝组织及肝细胞癌组织中叶酸受体免疫组化染色结果(DAB×200)A.正常肝组织;B.肝细胞癌组织

图3 正常肝组织及肝细胞癌组织中Delta样配体4免疫组化染色结果(DAB×200)A.正常肝组织;B.肝细胞癌组织

表1 叶酸受体和Delta样配体4在正常肝组织及肝细胞癌组织中的表达情况［例(%)］

图4 Western blot检测正常肝组织及肝细胞癌组织中FR和Dll4的表达 Dll4为Delta样配体4，FR为叶酸受体，βactin和GAPDH均为内参照

3 讨论

HCC作为常见的消化系统恶性肿瘤之一，手术局部病灶切除是其目前主要治疗手段，但由于手术切除率低、术后易复发转移等因素，患者的长期生存仍不理想。相对于传统治疗手段，分子靶向治疗已经成为HCC治疗发展的新方向。分子靶向治疗通过局部给药，在载体作用下，经血液循环选择性地定位于靶器官富集，载体携带的药物作用于靶细胞或细胞内特定结构［5］，具有靶向性和特异性强，毒副反应小，不易发生耐药，能够高效地杀伤肿瘤细胞而对正常组织损伤小等优点［6］。因此，HCC分子靶向治疗的关键在于选择靶向运送及药物作用靶点。

肿瘤组织由肿瘤细胞及肿瘤微环境组成。肿瘤微环境由细胞外基质、成纤维细胞、血管或淋巴管和免疫细胞组成，影响肿瘤生长、转移及抗癌药物疗效等［7］。在肝动脉化疗栓塞治疗HCC中，肿瘤血管新生是HCC复发、转移的重要因素［8］。国外有报道曾经提出可通过阻断肿瘤血管，抑制肿瘤生长和转移，从而治疗肿瘤［9］。目前以血管内皮生长因子(VEGF)及其受体为靶点的贝伐单抗和索拉非尼，已用于晚期HCC血管阻断治疗，具有一定效果，但其价格昂贵，且易出现多种严重毒副反应［10-11］。因此，探索毒副作用小、相对稳定的血管阻断新靶点，对提高HCC疗效有重要意义。

FR是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的跨膜单链糖蛋白，与其配体5-甲基四氢叶酸及游离叶酸特异地具有强亲和力，介导胞吞作用将叶酸修饰的药物及载体高效、特异地导入细胞［12］。FR在正常组织中，一般无表达或少量选择性地表达在极化的上皮细胞表面，使血液循环中叶酸修饰的药物不能通过FR介导进入正常组织，而在多数肿瘤细胞膜表面FR则呈现过度表达状态［13］。叶酸作为FR的配体，价格低廉，结构简单，分子量小，免疫原性低，稳定性好，经修饰与药物结合后仍可保持与FR的高度亲和力。FA-药物复合物通过FA与肿瘤组织高表达的FR特异性结合，局部细胞膜内陷形成早期核内体或“小泡”，发生了内吞作用。在内涵体的酸化作用下，FR的构型改变并转移到细胞膜进行下次转运，同时释放出FA-药物复合物，进而药物与FA间的连接键断裂，实现了携带的药物在肿瘤细胞内部释放［14］。因此利用FR在肿瘤和正常组织间的差异性表达、FR与FA及其衍生物特异性结合，可望实现药物对肿瘤的靶向运送，FR已成为肿瘤诊断和治疗研究的新靶点。本研究结果显示，FR在HCC组织特异性表达，而在正常肝组织中无表达。因此，FR可作为HCC治疗中药物靶向运送载体的靶点。

Notch信号通路是一个在进化过程中高度保守的细胞间信号转导通路，其中Dll4是Notch信号通路中的血管特异性配体，主要在新生血管的尖端细胞以及内皮细胞中表达，而在成熟的血管中较少表达［15］。Dll4在肿瘤组织中高表达，与肿瘤的恶性发展密切相关，对肿瘤发生、血管生成和血行转移具有重要调控作用［16］。Dll4在小鼠 ColO205、HM7等肿瘤血管及其周围组织表达明显上调，与Notch1受体结合后可调控内皮细胞的生物活性，影响肿瘤血管的生成［17］。在人乳腺癌、肾癌和膀胱癌的肿瘤组织中，Dll4亦呈现异常高表达，并导致肿瘤血管的动静脉分化［18］。新近的研究发现，VEGF和Dll4抑制剂联合使用对一些anti-VEGF治疗抵抗的肿瘤，抑瘤作用更明显［19］。阻断Dll4/Notch信号通路可使肿瘤无功能血管密度增加，从而致肿瘤血供不足、体积减小、血行转移减少［20］，同时还可减少肿瘤干细胞的数量，促进肿瘤细胞凋亡［21］。

本研究结果显示，HCC组织中Dll4蛋白高表达，主要表达在肿瘤血管内皮细胞及周围肿瘤细胞的细胞膜上。因此，Dll4可作为HCC血管阻断治疗的新靶点，但其在体内应用还存在非特异免疫原性、稳定性差、细胞内导入能力弱等问题。病毒载体亦存在宿主免疫反应、潜在致癌性、包载基因容量有限以及靶向性差等缺陷，并且由于Dll4在正常组织中广泛存在，对心血管发育、血管再生及动脉分化等具有调控作用，如果采用非靶向载体介导Dll4基因沉默，必将引起机体血管生成紊乱，产生严重的毒副反应。因而必须在HCC组织中寻找一个特异性的标志分子，作为Dll4分子药物运送的靶点，以提高药物作用的特异性，减轻毒副反应。

综上所述，HCC组织特异性表达FR;在肿瘤血管内皮细胞及周围肿瘤细胞的细胞膜上高度表达Dll4，因此，通过 FA修饰干扰Dll4表达的基因药物，以FR为药物运送靶点，Dll4为药物作用靶点，有望实现HCC的血管阻断靶向治疗。

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