津力达对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠血清瘦素、脂联素的影响

段力园，赵 静，刘颐轩，宋光耀

胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病以及多种代谢性疾病如肥胖、代谢综合征的共同病理生理基础，脂肪源性细胞因子分泌的异常与IR的形成和发展密切相关［1-3］。研究显示，多种单味中药，如黄连、人参、黄芪等可以改善IR［4-8］。津力达是由17味中药所组成的中药复方制剂，临床试验证实其可有效降低血糖，改善2型糖尿病患者的症状。既往研究表明，津力达可保护胰岛β细胞，增加胰岛素分泌，改善IR［9-11］，但其作用机制尚不明确。我们拟通过本研究，观察津力达对IR大鼠脂肪源性细胞因子分泌的影响，探讨其改善IR的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 雄性SD大鼠36只，体重125～145 g，购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所［合格证号:slxk(京)7009-0017］。饲养条件为:每笼2只，适应性喂养1周后称重，随机分为正常对照组12只和高脂饮食组24只。正常对照组给予正常基础饲料(总热量为348 kcal/100 g，碳水化合物占 65.5%、脂肪占10.3%、蛋白质占24.2%)，高脂饮食组给予高脂饲料(总热量为501 kcal/100 g，碳水化合物占20.1%、脂肪占59.8%、蛋白质占20.1%)，所有饲料购于河北医科大学实验动物中心。两组分别喂养6周后，每组随机选取6只行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验，判断造模是否成功。

1.2 高胰岛素－正葡萄糖钳夹试验 参考Kraegen等［12］于1983年建立的高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，具体操作步骤:随机选取6只大鼠禁食12 h，过夜后于次晨称重，空腹状态下以3%戊巴比妥钠(北京Solarbio公司)行腹腔注射麻醉，剂量为40 mg/kg。在麻醉状态下，于大鼠颈前右侧斜行剪开长1.5 cm切口，行右侧颈动、静脉插管，插入长度为2.0～2.5 cm，导管经皮下从颈后引出，用肝素(100 U/ml)抗凝封管，最后将导管结扎固定于颈后皮肤。大鼠清醒后单笼饲养，自由摄食、饮水，并注意保暖、抗感染。4～5 d后，大鼠应激状态消失，表现为体重恢复至插管前水平，再次禁食12 h，过夜，第2天清晨在清醒状态下行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验。颈动脉导管连接装有肝素生理盐水的注射器，浓度为50 U/ml;颈静脉导管通过三通管连接双通道微量注射泵(浙江医科大学，WZS-50F)，一端连接浓度为40 mU/ml胰岛素注射液(江苏万邦公司)，另一端连接30%葡萄糖注射液。先用血糖仪(美国罗氏，Advantage)测定大鼠基础血糖，然后以4 mU/(kg·min)的恒定速率输注胰岛素溶液，每间隔5 min测定1次血糖;当血糖降至低于基础值时，开始以9～14 mg/(kg·min)的速度输注30%的葡萄糖注射液，随后每间隔10 min测定大鼠血糖1次，根据血糖水平调整葡萄糖注射液的输注速率，使大鼠血糖稳定在(5.0±0.5)mmol/L。当血糖稳定后，每隔5 min测定1次血糖，记录连续6次血糖的平均值，计算葡萄糖输注率(GIR)。GIR=血糖稳定时葡萄糖输注速率×葡萄糖浓度/体重(g)/60，此结果即为评价大鼠胰岛素敏感性的指标。

1.3 药物干预 高胰岛素－正葡萄糖钳夹试验确定IR大鼠模型造模成功后，将高脂饮食组剩余18只大鼠随机分为高脂饮食对照组、津力达组和二甲双胍组，每组6只。津力达组给予津力达(石家庄以岭药业股份有限公司)超微粉末生理盐水混悬液3.0 g/(kg·d)灌胃;二甲双胍组给予二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司，批号:1401080)粉末生理盐水混悬液0.2 g/(kg·d)灌胃;正常对照组和高脂饮食组给予与二甲双胍组等量生理盐水灌胃，每天9:00灌胃1次，持续8周。正常对照组继续给予基础饲料喂养，其余各组继续高脂饲料喂养，药物干预期间饲养条件不变，根据体重调整给药量。

1.4 大鼠血清指标的测定 药物干预8周后，大鼠禁食12 h过夜，次晨称重并用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，并在麻醉状态下开腹，选取腹主动脉取血，所采血标本中加入总体积1%的肝素抗凝剂，收集后室温(20～50℃)静置30 min，低温离心机(德国Hettich公司，EBA12R)3000 r/min离心15 min，取上清，-80℃低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司，DW86L486)分装保存以备使用。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)测定瘦素、胰岛素、脂联素、抵抗素、游离脂肪酸(FFA)，严格按照说明书进行操作。具体操作步骤:取出 ELISA试剂盒，于室温(20～50℃)放置30 min;取出酶标板，按照标准品的次序分别加入50μl的标准品溶液于空白微孔中;空白孔中加入50μl样品，空白对照孔加入50μl PBS(pH 7.0～7.2);在各孔中加入100μl的酶标记溶液(不含空白对照孔);将酶标板用封口胶密封后，37℃孵育箱(上海浦东跃欣科学仪器厂，101A-2)孵育反应1 h;用试剂盒中提供的清洗液(浓缩洗涤液以1∶100的比例与蒸馏水稀释)充分清洗酶标板5次，保持各孔有充足的水压;酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干;各孔加入显色剂A和B各50μl;37℃下避光反应10～15 min;各孔加入50μl终止液，终止反应;用酶标仪(芬兰，Multiskan Mk3)于560 nm处测定吸光率。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用完全随机设计单因素方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 GIR 喂养6周后高脂饮食组GIR为(14.9±0.82)mg/(kg·min)明显低于正常对照组(26.5±0.78)mg/(kg·min)(P＜0.05)。提示高脂饮食组大鼠出现明显的IR［13］，高脂饲料喂养成功建立了IR大鼠模型。药物干预8周后，GIR正常对照组为(27.1±0.89)mg/(kg·min)，高脂饮食对照组为(15.5±0.69)mg/(kg·min)，津力达组为(23.9 ±0.81)mg/(kg·min)，二甲双胍组为(24.3±0.69)mg/(kg·min)。高脂饮食对照组GIR较正常对照组降低，津力达组及二甲双胍组GIR较高脂饮食对照组升高(P＜0.05)，但两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 血清指标 药物干预8周后，高脂饮食对照组血清瘦素、胰岛素、抵抗素、FFA较正常对照组升高，脂联素水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。与高脂饮食对照组比较，津力达组和二甲双胍组血清瘦素、胰岛素、抵抗素、FFA水平均降低，血清脂联素水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，但两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 药物干预8周后4组大鼠血清瘦素、胰岛素、脂联素、抵抗素、游离脂肪酸的变化(x±s)

3 讨论

近年来，由于人们生活水平的提高和不健康的饮食方式，高脂血症的发病率逐年升高。高脂血症是促使IR、动脉粥样硬化、冠心病等疾病发生的重要危险因素［13］。这些疾病可以造成人体多种靶器官的损害，严重降低了患者生活质量，缩短了患者的预期寿命。据报道，我国≥18岁居民血脂异常率高达18.6%［14］。目前高脂血症尚无统一的诊断标准。一般来讲，血浆总胆固醇浓度＞5.72 mmol/L即可定为高胆固醇血症，血浆甘油三酯浓度 ＞1.70 mmol/L为高甘油三酯血症。临床主要应用的降脂类药物有他汀类、烟酸及其衍生物、贝特类等药物，而调整饮食习惯及增加体育活动、控制体重等生活方式的改变是预防和治疗血脂异常的关键。

研究表明，脂肪组织不仅是能量储备器官，还是一个代谢活跃、功能复杂的内分泌器官［15］。脂肪组织可以分泌许多与糖和脂肪代谢相关的脂肪因子，通过这些因子广泛地影响和调节机体的能量代谢及各种功能［16］，其中瘦素、胰岛素、脂联素、抵抗素和FFA在IR的形成和发展中起着重要作用。

瘦素主要由白色脂肪组织产生，可以引起食欲缺乏和机体能量消耗增加从而使体重减轻，有观点认为，瘦素是IR发展的独立危险因素［17］。在肥胖以及IR状态下，往往表现为瘦素抵抗，即高瘦素血症，但因其与受体结合障碍或者受体表达下调，血清瘦素不能发挥生理作用，从而产生瘦素抵抗［18］。本实验中，高脂饮食对照组中血清瘦素、胰岛素水平升高，表明高瘦素血症使“脂肪-胰岛素轴”反馈机制破坏，导致高胰岛素血症或IR，或将进一步导致肝内脂肪蓄积。津力达和二甲双胍均能降低血清瘦素以及胰岛素水平，减轻高瘦素血症以及IR。

脂联素是由脂肪组织分泌的唯一发挥保护作用的脂肪细胞因子，在体内的生理作用主要是增加胰岛素敏感性，促进脂肪代谢，增加能量消耗，抑制内源性葡萄糖生成从而使IR减轻［19］。而在肥胖以及IR患者血中脂联素浓度明显下降，导致胰岛素敏感性下降、血压升高、动脉粥样硬化等。本实验中津力达和二甲双胍干预后均不同程度地增加了血清脂联素水平，可能在一定程度抑制了动脉粥样硬化发生。

抵抗素存在于血浆中，是脂肪细胞分泌的富含半胱氨酸的多肽类激素［20］，国内外研究的焦点主要为其与肥胖、糖尿病之间的关系。抵抗素可能是肥胖和IR之间的重要链接，2型糖尿病的发生可能与抵抗素表达水平增高有关［21］。已有研究表明，抵抗素在人胰岛中有表达［22］，抵抗素可以作用于胰岛素信号转导途径，导致IR。但有关抵抗素对胰岛分泌功能的研究尚未见报道。本实验中津力达和二甲双胍均能降低抵抗素水平，减轻IR。

FFA升高可以增加肝脏内源性葡萄糖生成，减少组织对葡萄糖的摄取［23］，导致空腹血糖升高及高胰岛素血症，FFA在组织和血液中含量增加可以导致IR的形成，并在IR的发展中起着负面的作用。

本研究证明，高脂饮食成功诱导了IR大鼠模型，同时瘦素、胰岛素、抵抗素和FFA含量升高，脂联素浓度降低。说明高脂饮食使大鼠脂肪分解增加，FFA含量升高，干扰胰岛素信号转导，影响了糖脂代谢;同时，对糖脂代谢有正面调节作用的脂联素水平下降，从另一方面影响了胰岛素敏感性，最终导致IR。本实验结果表明，津力达和二甲双胍均能使高脂饮食对照组脂肪细胞因子的分泌趋于正常，间接证实了脂肪细胞因子分泌失调与IR的发生密切相关;并且，中成药津力达的功效接近于二甲双胍，能够明显降低瘦素、抵抗素和FFA水平，提高脂联素水平，这可能是其改善IR的部分作用机制。

目前临床治疗IR主要应用双胍类、格列酮类、降脂类药物等。然而，这些药物引起的不良反应，如乳酸性酸中毒、肝肾损害、肌肉疼痛等，导致部分患者不能耐受，从而不能够长期坚持服用。我国传统的中医中药在治疗高脂血症、IR等慢性疾病方面有着巨大的优势和潜力。动物实验显示津力达与目前广泛应用的治疗药物疗效相当。当然，其疗效及不良反应还需临床试验的进一步证实。

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