三种华法林基因预测模型与心脏瓣膜置换术后华法林剂量的相关性研究

彭 齐，陶 凉，陈晓英，胡大清

华法林是目前临床最常用的口服抗凝药物，影响华法林用药剂量的因素主要有遗传因素以及身高、体重、年龄、性别、种族、药物相互作用等。华法林国际药理学联盟(IWPC)的研究显示，加入药物基因组学的预测模型(包括基因型)比临床预测模型(不包括基因型)准确性提高了80%［1］。所以个体的遗传特征对于华法林的剂量影响很大。目前研究发现与华法林药效学和药动学相关的基因达30多种，其中起主要作用的有2种，即细胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)。美国食品药品监督局(FDA)在华法林用药说明书中介绍了CYP2C9和VKORC1基因对剂量的影响并建议在用药之前做基因检测［2］。本文旨在对不同华法林基因预测模型与华法林剂量的相关性进行研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2012年3—8月在武汉亚洲心脏病医院心脏外科行心脏瓣膜置换术患者108例。入选标准为:汉族、＞18岁、稳定华法林抗凝至少3个月、国际标准化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除标准:肝、肾及甲状腺功能异常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及维生素K等影响INR的药物。所有入选对象均来自湖北省各地区就诊的汉族居民，相互间无血缘关系及异族通婚史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:收集入选受试者静脉血(枸橼酸钠抗凝)3 ml用于检测 INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同时观察患者华法林稳态剂量及3种基因预测模型的华法林剂量。

1.2.2 基因检测方法:从血液中提取患者DNA，扩增目的片段，再进行测序反应。DNA提取采用TIANGE血液基因组提取试剂盒，测序仪为美国ABI 3500 Genetic Analyzer。

1.3 预测模型 从以下3个模型来分析基因检测的准确性，一方面采用美国FDA给出的基因型判断用药范围(模型1)，并与出院剂量比较分析;另一方面采用2009年国外发表的预测模型(模型2)［1］，模型的建立包含了4043个样本，含1200个亚洲人。同时还比较了Huang等［2］建立的中国人用药模型(模型3)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，Pearsonχ2检验用于检查基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

2 结果

2.1 基因型分布 108例患者血样，来自武汉亚洲心脏病医院，取样时间为2012年3—8月，男50例，女58例。108例中CYP2C9*3杂合突变8例，未发现CYP2C9*2突变;VKORC1突变105例，其中纯合突变95例，杂合突变10例。

2.2 不同基因型华法林稳态剂量比较 108例中CYP2C9基因型检测有100例为*1/*1型、8例为*1/*3型、未发现*2突变，华法林稳态剂量分别为(2.68±1.05)、(1.55±0.78)mg/d，*1/*3型较*1/*1型华法林稳态剂量小，差异有统计学意义(P＜0.05);VKORC1基因型检测有95例为AA型、10例为杂合子GA型、3例为纯合子GG型，华法林稳态剂量分别为(2.46±0.85)、(3.15±1.22)mg/d，AA型较GA型华法林稳态剂量小，差异有显著统计学意义(P＜0.01);VKORC1基因型GG型仅3例，未做组间比较。

2.3 基因检测显著提高准确率 根据基因型判断的用药量与实际用药剂量相关性更大，准确率更高。同时预测模型3是中国人用药模型，其相关性略高于预测模型2，同时美国FDA根据基因型给出的用药敏感性与实际用量是吻合的，说明基因型对于判断用药量非常有帮助。模型1预测剂量与华法林稳态剂量之间的相关性见图1;模型2加基因型与不加基因型预测剂量与华法林稳态剂量之间的相关性见图2、3;模型3预测剂量与稳态剂量之间的相关性见图4。

图1 预测模型1预测剂量与华法林稳态剂量的相关性FDA根据基因型给出的用药范围与出院剂量之间的比较，-1表示敏感性高;0表示敏感性一般;1表示敏感性低

图2 预测模型2不加基因型预测剂量与华法林稳态剂量相关性(R2=6.4%，P=0.0127)

图3 预测模型2包括基因型预测剂量与华法林稳态剂量相关性(R2=31.3%，P＜0.0001)

图4 预测模型3预测剂量与华法林稳态剂量的相关性(R2=33.6%，P＜0.0001)

3 讨论

目前研究发现在与华法林药效学和药动学相关的基因中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因。细胞色素氧化酶P450是人类肝脏中由CYP超基因家族编码的一种重要的药物代谢酶系统。CYP2C9是CYP2C亚家族中的一种同工酶，约占肝微粒体中CYP总量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位点，其中研究较多的也最常见的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中国人群中CYP2C9*3变异位点相对更多，主要是第359位的氨基酸由异亮氨酸变成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突变基因携带者华法林需求量较野生型患者低，且CYP2C9*3携带者出血风险较高。VKORC1基因位于16号染色体，含3个外显子，编码163个氨基酸的18KDa内质网跨膜蛋白［3］。此蛋白质为组成维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位之一，主导维生素K依赖性凝血因子的生成，是华法林的作用靶点。VKORC1基因启动子区-1639G＞A多态性与华法林临床用药剂量相关，AA型华法林需求量较GA型低。在中国患者中三者的频率分别是79.7% 、17.6% 和 2.7%［4］。

目前临床上华法林的给药方案通常是首先给予一定标准剂量，然后临床医生根据每个患者INR的情况，调整剂量直至INR达到靶目标。但是调整剂量周期较长，且患者发生血栓或出血的可能性较高［5-6］。因此，国内外越来越多的学者开始建立华法林用药剂量预测模型。这些模型并不能取代INR的监控作用，但是能够极大的提高华法林用药剂量的准确性［7-9］。华法林IWPC联合9个国家的21个研究小组，提供了用华法林治疗的超过4000例患者(亚洲人种1200余例)的临床和遗传学数据，并据此建立了华法林剂量预测模型，该模型中纳入了遗传因素以及临床因素。结果表明，对于需要低剂量(≤21 mg/周)或高剂量(≥49 mg/周)治疗的患者，纳入遗传因素的华法林剂量模型预测结果显著优于临床预测模型。IWPC发表的研究显示，加入药物基因组学的预测模型(包括基因型)比临床预测模型(不包括基因型)准确性提高了80%［1］。Gage等［10］基于1015例样本(混合种族)也建立了剂量预测模型，其中纳入了最全面的非遗传因素。这两个模型是目前最权威的华法林剂量预测模型。

IWPC的研究表明，亚洲人IWPC预测模型效果虽然比临床预测模型优越，但较白种人差。在这些模型中，目标INR设定为2.0～3.0，而实际上中国人目标INR有所不同，且中国人与华法林剂量相关的基因突变频率与高加索人差异较大［11］。因此，很多学者开始建立针对中国人的华法林剂量预测模型。从中可以看出，遗传因素的纳入使得模型对华法林剂量个体差异的解释达到了74.3%。值得一提的是，与针对高加索人的华法林剂量预测模型不同的是，华人剂量预测模型纳入的大都是CYP2C9*3，而不是CYP2C9*2，这是因为CYP2C9*2在中国人群中的分布频率极低。

综上所述，导致华法林用药剂量个体差异分遗传因素和非遗传因素，其中遗传因素占主要地位。近年来，随着研究的深入，针对中国人华法林剂量构建的预测模型已越来越多，且纳入了遗传因素，可解释40% ～74%的个体剂量差异［12-14］。本研究表明，预测模型3预测剂量与华法林稳态剂量相关性略高于预测模型2，可见根据中国人数据建立的模型更适合中国人。但是，目前基于中国人群构建的剂量预测模型存在样本量较小、纳入的影响因素少以及缺少外部验证等弊端。因此，我们需要更大样本量的研究，对已构建的模型进行验证或是构建新模型。我们也需要纳入更多的遗传和非遗传因素，以期提高对华法林剂量个体差异的解释百分比。此外，目前构建的模型多为稳态剂量预测模型，而对起始剂量预测模型和稳态剂量的精确模型研究较少［15-17］。因此，在以稳态剂量预测模型为基础的前提下，进一步丰富起始剂量模型和稳态剂量的精确模型的构建，以期更好地应用于临床。

模型1:

模型2:

Square root of weekly warfarin dose=5.6044-0.2614×Age in decades+0.0087×Height in cm+0.0128×Weight in kg-0.8677×VKORC1^A/G-1.6974×VKORC1 A/A-0.4854×VKORC1 genotype unknown-0.5211×CYP2C9*1/*2-0.9357×CYP2C9*1/*3-1.0616×CYP2C9*2/*2-1.9206×CYP2C9*2/*3-2.3312×CYP2C9*3/*3-0.2188×CYP2C9 genotype unknown-0.1092×Asian race-0.2760×Black or African American-0.1032×Missing or Mixed race+1.1816×Enzyme inducer status-0.5503×Amiodarone status

Legend for use of algorithms:

· Age in decades=1 for 10-19，2 for 20-29，etc…

· VKORC1 G/A=1 if heterozygous for rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 A/A=1 if homozygous for A at rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 genotype unknow n=1 if rs 9923231 genotype missing or unknown，otherwise zero

· CYP2C9*1/*2=1 if CYP2C9 genotype is*1/*2，otherwise zero

· CYP2C9*1/*3=1 if CYP2C9 genotype is*1/*3，otherwise zero

· CYP2C9*2/*2=1 if homozygous for CYP2C9*2 allele，otherwise zero

· CYP2C9*2/*3=1 if CYP2C9 genotype is*2/*3，otherwise zero

· CYP2C9*3/*3=1 if homozygous for CYP2C9*3 allele，otherwise zero

· CYP2C9 genotype unknow n=1 if CYP2C9 genotype unknown，otherwise zero

· Asian Race=1 if self-reported race is Asian，otherwise zero

· Black/African America n=1 if self-reported race is Black or African American，otherwise zero

· Missing or Mixed race=1 if self-reported race is unspecified or mixed，otherwise zero

· Enzyme inducer status=1 if patient taking carbamazepine，phenytoin，rifampin，or rifampicin，otherwise zero

· Amiodarone status=1 if patient taking amiodarone，otherwise zero

模型3:

predicted warfarin dose(mg/day)=exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484 TC+0.554×VKORC1 6484 CC-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3).Age is given in years，BSA calculated from height and weight is given in square meters，and VKORC1 6484 TC，VKORC1 6484 CC，CYP2C9*1/*3，and CYP2C9*3/*3 are coded as 1 if present and 0 if absent.

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