茶多酚EGCG对HepG2细胞脂质代谢基因和长链非编码RNA表达的影响*

刘岗, 郑欣馨，鲁洁，陈敬州，黄晓红

茶多酚EGCG对HepG2细胞脂质代谢基因和长链非编码RNA表达的影响*

刘岗, 郑欣馨，鲁洁，陈敬州，黄晓红

目的：通过生物芯片技术观察茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对HepG2细胞脂质代谢相关基因和长链非编码RNA（lncRNAs）表达的影响并探讨后两者可能的作用关系。

表没食子儿茶素没食子酸酯；脂质代谢；长链非编码核糖核酸；生物芯片

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1039.)

茶多酚是绿茶中的主要有效成分。绿茶多酚又以儿茶素为主，其中表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG） 含量最高，约占儿茶素的80%。以往研究表明茶或茶多酚能降低血浆胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平, 预防动脉粥样硬化发展[1,2]，而茶多酚降脂作用的机制仍不明确。长链非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，近年来研究发现lncRNAs在心脏发育及心血管疾病发生发展中发挥了重要作用[3]。本研究运用基因芯片技术，研究茶多酚EGCG对HepG2细胞脂质代谢相关基因以及lncRNAs表达的影响，从分子水平探讨茶多酚影响脂质代谢的可能作用机制。

1 材料与方法

材料：EGCG（纯度＞95%）购自Sigma 公司（美国）。EGCG溶解于0.1%二甲基亚砜（DMSO）溶液4℃贮存备用。HepG2 细胞株购自上海博谷生物科技有限公司。

细胞培养和RNA 提取：将HepG2 细胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素以及 100 μg/ml的链霉素的DMEM培养液于37℃、5% CO2浓度及饱和湿度的恒湿培养箱中培养。当细胞密度达到5×106～1×107/ml 时，收集对数生长期细胞分别接受以下2种处理：25 μmol/L EGCG（EGCG组）和0.1% DMSO（对照组）处理24 h。采用Trizol总抽提试剂盒 （Invitrogen公司，美国）抽提RNA。采用A260/280 分光光度比值及变性凝胶电泳鉴定mRNA质量。

样品标记和芯片杂交：采用Affymetrix公司Human Transcriptome Array 2.0全转录组基因表达芯片（HTA2.0）。该芯片设计了约七百万条特异性探针，覆盖人类基因组上近24万条编码RNA转录本和4万条非编码RNA转录本。样品RNA按照Affymetrix公司的基因表达扩增、标记试剂盒说明书进行操作（Affymetrix公司,美国）。首先对样品中的总RNA进行逆转录，然后通过生物素标记的核糖核酸和末端转移酶，以体外转录（IVT）的方式扩增并标记cDNA探针。芯片杂交按照Affymetrix公司的标准化操作流程和提供的配套试剂盒 （Affymetrix公司,美国）进行，在滚动杂交炉中45℃，16小时滚动杂交，杂交完成后按照Affymetrix提供的标准操作流程进行芯片的洗涤。

芯片扫描及数据分析：芯片结果采用GeneChip®Scanner 3000 （Affymetrix公司,美国）进行扫描，用Command Console Software 3.1 （Affymetrix公 司 ,美国）读取原始数据，质控合格的数据采用Expression Console进行归一化处理。差异基因筛选标准：两组差异为有效基因，且EGCG组单个样本Fold Change（探针在细胞中表达差异程度） ≥1.5或 ≤-1.5。运用生物信息学的方法对差异lncRNA进行靶基因预测。利用UCSC基因组浏览器在lncRNA的位置上下游10 kbp范围内寻找相关mRNA-顺式作用[4]。根据与mRNA的序列互补性及RNA二级结构预测算法，评价lncRNA与mRNA结合的能力，通过BLAST软件初筛后用RNAplex软件筛选出lncRNAs反式作用的靶基因[5]。

实时荧光定量多聚酶链反应（PCR）验证：HepG2细胞经EGCG 10 μmol/L 和25 μmol/L处理后，运用实时定量PCR法验证lncRNA AT102202、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶及低密度脂蛋白受体。PCR 反应采用SYBR Green PCR 试剂盒（Takara公司，日本），在FTC3000 实时定量PCR 仪上进行，反应条件如下：95℃，3min；（1 个循环），95℃，30 s, 62℃，40 s；（40 个循环）。PCR 引物由上海生工公司合成：低密度脂蛋白受体（forward primer：5’GGTCTTTACGTGTTCCAAGG3’；reverse primer：5’CGCAGTTTTCCTCGTCAGAT3’）。 羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（forward primer：5’GCAGCAAACATTGTCACCG3’; reverse primer：5’CACCACCCACCGTTCCTAT3’）, AT102202（forward primer：5’AAAGTTTGCCCTCAGTTCCA 3’；reverse primer：5’GCAGCCAAAGCAGCACATAA 3’）。选择3-磷酸甘油醛脱氢酶作为内参基因，间接标定靶cDNA 含量。用比较阈值法2（-ΔΔCT）计算EGCG组和对照组之间的基因表达水平的差异。

统计学分析：应用SPSS16.0统计软件进行数据处理，数据用均数±标准差表示，两组比较采用独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

细胞总RNA：A260/A280 值在1.9～2.0 之间，显示RNA质量良好，可供后续研究。

茶多酚EGCG对HepG2细胞脂质代谢相关基因和lncRNA表达的影响：芯片结果显示有27条脂质代谢相关基因差异表达有统计学意义（P＜0.05）。其中12条表达上调，15条表达下调，主要涉及脂质合成与代谢、脂蛋白转运与代谢、胞核受体（表1）。其中有11个基因主要涉及胆固醇代谢，如羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶、低密度脂蛋白受体及乙酰辅酶A乙酰转移酶2（ACAT2）等，表明茶多酚EGCG可直接影响肝细胞的胆固醇代谢。此外, 茶多酚EGCG处理后共有180个lncRNA表达下调，85个lncRNA表达上调（P＜0.05）。其中共有29条lncRNAs的表达差异在2倍以上（表2）。

表1 25μ mol/L 茶多酚EGCG处理HepG2细胞后芯片筛选出的差异表达脂代谢基因

表2 25μ mol/L茶多酚 EGCG处理HepG2细胞后芯片筛选出差异性表达2倍以上的lncRNA

lncRNA的靶基因预测: lncRNA可能通过调控相应的mRNA发挥功能，因此本研究根据生物信息学的方法对这些差异lncRNA进行靶基因的预测，发现有5个脂代谢相关基因的表达可能受相关lncRNA的顺式调控（表3），其中AT102202预测的靶基因为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶。AT102202是一长度为303个核苷酸的lncRNA，含4个外显子，其3个外显子与羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因第4～6外显子高度重合（来自UCSC数据库），并且两者的表达改变方向相反，提示AT102202可能通过顺式作用抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的表达。此外，另一靶基因-ACAT2可能即受lncRNA（N342928）的顺式调控亦可受lncRNA（AT115872）的反式调控。

实时荧光定量PCR验证：结果显示10 μmol/L和25μmol/L EGCG处理后，AT102202与低密度脂蛋白受体表达均增加（P＜0.05），而羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的表达呈显著性下降（P＜0.05, 图1）。说明茶多酚EGCG诱导的差异基因的表达在实时定量PCR 和芯片结果具有一致性。

表3 长链非编码RNA的靶基因预测

图1 荧光定量多聚酶链反应分析EGCG处理后对HepG2 细胞中长链非编码RNA AT102202（1A）、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（1B）、低密度脂蛋白受体（1C）mRNA水平的影响

3 讨论

本研究采用生物芯片技术证实了茶多酚EGCG可广泛地影响脂质代谢相关基因的表达，涉及了脂质合成、转运、代谢和降解各个过程。同时，EGCG能上调或下调数量众多的lncRNA表达。我们通过生物信息学的方法建立了这些脂代谢相关基因与lncRNA的作用关系，提示这些lncRNA可能参与了EGCG对脂质代谢相关基因表达的调控过程。

低密度脂蛋白胆固醇水平增高是影响动脉粥样硬化发生与发展的主要危险因素，因此降低低密度脂蛋白胆固醇成为降脂治疗、防治动脉粥样硬化性疾病的首要目标。最近一项纳入1136名人群的荟萃分析系统评价了饮用绿茶或口服绿茶提取物对血脂谱的影响，结果表明绿茶多酚可显著性地降低血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平[1]。另一项大规模的流行病学研究显示绿茶多酚的摄入量与高脂血症的发病与进展呈负相关，常年饮用绿茶≥2杯/天的人群具有更低的血脂水平，并且死于心血管疾病的风险降低达22%～33%[2]。因此我们推测绿茶多酚的降脂效应可能是其心血管保护作用的重要原因。

芯片结果发现茶多酚EGCG可显著地上调低密度脂蛋白受体和ACAT2的基因表达。低密度脂蛋白受体是调节血浆低密度脂蛋白胆固醇水平的细胞跨膜糖蛋白，在降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平中发挥关键作用，可介导血中近2/3的低密度脂蛋白胆固醇进入肝细胞降解[6]。因此茶多酚EGCG增加低密度脂蛋白受体的表达，并由低密度脂蛋白受体介导的低密度脂蛋白胆固醇的内吞作用可能是其降低血浆胆固醇水平的主要机制之一。茶多酚EGCG降脂活性的另一个候选基因为ACAT2。ACAT2 主要作用是催化肝细胞内胆固醇酯的生成，在肠道胆固醇的吸收，极低密度脂蛋白的合成和分泌以及细胞内胆固醇的储存方面起重要作用[7]。以上表明茶多酚EGCG可直接作用于胆固醇的代谢过程，为绿茶多酚的降脂和心血管保护作用提供了有力的理论基础。

此外，我们发现茶多酚EGCG可显著地降低羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的表达，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶是细胞内胆固醇合成的限速酶和胆固醇反馈调节的主要节点，也是他汀类药物作用的靶点[8]。全基因组关联研究表明羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶单核苷酸多态性是决定血浆胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平的重要因素之一，其效应大小（Effect Size）与载脂蛋白B和低密度脂蛋白受体相近[9]。本研究中，我们观察到茶多酚EGCG降低羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶表达同时可增加低密度脂蛋白受体基因的表达。因为低密度脂蛋白受体基因的表达主要受到细胞内胆固醇内水平经过反馈机制在转录水平调节。当细胞内胆固醇含量降低时，转录因子-胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）活化并进入胞核激活靶基因低密度脂蛋白受体的表达[6]。因此EGCG可能通过抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶表达，降低细胞内胆固醇合成从而反馈性地增加低密度脂蛋白受体基因的表达。

目前，lncRNAs在脂代谢中的作用仍不清楚。本研究利用基因芯片技术观察到EGCG可广泛地引起lncRNAs基因表达的改变。这些表达差异的lncRNAs可能参与了茶多酚EGCG对心血管的保护作用包括它的降脂效应。本研究首次通过生物信息学的方法构建了这些脂代谢基因与lncRNAs的关系，结果发现多个脂代谢相关基因可能受lncRNAs的顺式抑或反式调控。其中lncRNAAT102202预测的靶基因即为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，两组在基因位置上重叠并且表达改变方向相反，提示AT102202可能通过某种机制抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的表达。LncRNAs对基因表达的调控作用表现为多样复杂性，它既可与染色质修饰复合物（如PcG蛋白复合体）结合引起特异性的组蛋白修饰模式，通过表观遗传作用激活或抑制转录[10,11]，亦可通过多种机制在转录水平激活或抑制基因表达，如lncRNA能够和靶基因启动子区域形成RNADNA3螺旋结构，从而阻止转录因子TFIID的结合抑制基因的表达[12]。而AT102202对羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的作用关系及机制仍需今后的功能研究证实，若能阐明这些问题，将有望成为潜在的降脂治疗新靶标。

综上所述，绿茶多酚可广泛地引起脂质代谢基因和lncRNA表达的改变，而lncRNA可能在脂质代谢基因表达中发挥了调控作用。今后对lncRNA在脂代谢调控作用的阐明有望成为降脂治疗的新的靶标。

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Effects of Epigallocatechingallate on Lipid Metabolism Related Gene and Long Non-coding RNA Expression Profile in HepG2 Cells

LIU Gang, ZHENG Xin-xin, LU Jie, CHEN Jing-Zhou, HUANG Xiao-hong.
Department of Special Medical Treatment Center, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China.

HUANG Xiao-hong, Email: huangxhong12@gmail.com

Objective: To investigate the effects of epigallocatechingallate (EGCG) on lipid metabolism related gene and long noncoding RNA (lncRNA) expression prof i le by biochip technology, and to explore the possible relationship between the two elements.Methods: HepG2 cell was cultured with EGCG at 25μ mol/L for 24 hours, the total RNA was extracted and hybridized into the biochip of Human Transcriptome Array 2.0 for mRNA and lncRNA expression profile analysis. Bioinformatics technology was used to establish the possible relationship between lncRNA and the predicted target genes; the data obtained from biochip microarray was conf i rmed by real time RT-PCR examination.Results: The microarray revealed that EGCG treated HepG2 cell expressed 27 differential lipid metabolism genes and 11 of them involved in cholesterol metabolism. In addition, there 285 lncRNA expressions were up- or down-regulated. Bioinformatics technology indicated that the predicted target genes for lipid metabolism might be cis- or trans-regulated by lncRNA; the data from real-time RT-PCR was consistent with the data from biochip microarray.Conclusion: Tea polyphenols improves lipid metabolism and lncRNA might be involved in the regulation of lipid metabolism related gene.

Epigallocatechingallate; Lipid metabolism; Long non-coding RNA; Biochip

2014-03-12）

（编辑：常文静）

国家自然科学基金（81241007）

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 阜外心血管病医院 特需医疗诊治中心

刘岗 博士研究生 主要从事心血管病研究 Email：liugang327@126.com 通讯作者：黄晓红 Email：huanxhong12@gmail.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1039-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.019

方法:人HepG2细胞经EGCG（25 μmol/L）处理24 h 后，抽提RNA，并杂交至Human Transcriptome Array 2.0芯片进行mRNA和lncRNAs表达谱的分析。通过生物信息学进行靶基因预测建立两者的可能作用关系，并应用实时荧光定量多聚酶链反应（PCR ） 技术对芯片结果验证。

结果: HepG2细胞经EGCG处理后表达差异的脂质代谢相关基因为27条，其中11条涉及胆固醇代谢。此外，芯片结果显示有285条lncRNAs表达上调或下调。靶基因预测发现多个脂代谢基因可能受lncRNAs顺式或反式调控，实时定量PCR验证与芯片结果一致。

结论: 茶多酚EGCG可直接改善脂质代谢包括胆固醇的代谢，lncRNAs可能参与了对脂质代谢基因的表达调控。