丙氨酰谷氨酰胺对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白43重构的影响及其机制

鲍宏刚，张卫泽，李涛，陈永清，马凌，贾俊杰，徐志勇

丙氨酰谷氨酰胺对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白43重构的影响及其机制

鲍宏刚，张卫泽，李涛，陈永清，马凌，贾俊杰，徐志勇

目的：研究丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）诱导热休克蛋白70（HSP70）高表达对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化及缝隙连接蛋白43（Cx43）重构的影响及其机制。

丙氨酰谷氨酰胺;心肌纤维化;缝隙连接蛋白43;细胞外信号调节激酶;热休克蛋白70

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1024.)

心肌缺血后心室重塑是慢性心力衰竭的重要环节，而心肌纤维化和缝隙连接蛋白43（Cx43）重构是心室重塑的重要表现形式，心肌纤维化和Cx43重构不仅影响心肌收缩和舒张功能，而且易致心律失常的发生，使猝死的发生率增加[1-8]。有研究指出细胞外信号调节激酶通路的激活可参与心肌缺血后心室重塑即心肌纤维化和Cx重构[9-11]，此外尚有研究[12]指出通过热应激诱导心肌组织表达热休克蛋白70（HSP70）可影响细胞外信号调节激酶通路中磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达，在一定程度上抑制该通路的激活。但诱导HSP70表达升高是否可通过抑制细胞外信号调节激酶信号通路的激活而改善心肌纤维化程度及Cx43重构，相关报道少见。近期研究发现谷氨酰胺可以诱导HSP70的表达[13]，故本研究选择丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gln）作为谷氨酰胺的供体诱导HSP70表达，采用参考文献[14]方法皮下多点注射大剂量盐酸异丙肾上腺素（ISO）建立大鼠心肌缺血模型， 观察Ala-Gln诱导HSP70高表达对大鼠心肌纤维化和Cx43重构的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

实验材料：实验起止时间2013-04至2013-05。实验动物：SPF级雄性SD大鼠（购自甘肃省中医学院实验动物中心）32只，平均体重 （200±20）g。 注射用丙氨酰谷氨酰胺（海南灵康制药有限公司），二甲基亚砜（DMSO，上海碧云天生物技术有限公司），槲皮素（美国Sigma公司），盐酸异丙肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司），兔抗鼠connexin 43抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗鼠HSP70抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗鼠p-ERK1/2抗体（武汉博士德生物工程有限公司），羊抗兔生物素标记性二抗（武汉博士德生物工程有限公司），DAB染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

实验分组及动物模型的建立：32只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法随机等分为4组：对照组、ISO[5mg/（kg.d）]组（模型组）、ISO[5mg/（kg.d）]+Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]组（干预组）、ISO[5mg/（kg.d）]+槲 皮 素 [100 mg/（kg.d）] +Ala-Gln [0.75 mg/（kg.d）]+DMSO组（槲皮素组）。模型组、干预组、槲皮素组大鼠按5 mg/kg体质量腹部皮下多点注射ISO，1次/d，连续7天；干预组于ISO注射前60 min按0.75 mg/kg体质量给予Ala-Gln溶液（Ala-Gln+0.9%Nacl配成浓度为3.3%的溶液）腹腔注射1次/d，连续4周；槲皮素组在给予Ala-Gln溶液前6小时，按100 mg/kg体质量给予槲皮素（一种热休克蛋白抑制剂）腹腔注射，使用时溶解于DMSO中，1次/d，连续4周。对照组大鼠分别在相应时间内皮下注射生理盐水至第7天、腹腔注射与模型组、干预组、槲皮素组等量的生理盐水至第4周。大鼠心肌缺血模型的鉴定采用伊红素（HE）染色法，而且经过预实验鉴定结果证实此种造模方法可取，32只SD大鼠均完成整个实验过程。 取材及标本保存： 各组大鼠按上述方案实施至第4周时处死。取部分心肌组织置于中性甲醛液中固定24小时，经石蜡包埋后，连续切片5张，每张厚3 μm，2张用伊红素染色和马森（Masson）染色，其余3张用免疫组化法观察心肌组织中HSP70、p-ERK1/2及Cx43表达及分布。

大鼠心肌组织病理改变及胶原容积分数（CVF）计算 ： 心肌石蜡组织切片常规伊红素染色，光镜400倍下观察心肌肌纤维化及心肌细胞排列情况并摄片，Masson染色后每张切片选取4个不重叠无血管视野（×400）拍照，运用Image-Pro plus 5.0图像扫描软件进行图像分析，计算心肌CVF。CVF（%）=胶原面积/全视野面积×100%。

免疫组化法观察大鼠心肌组织中HSP70、p-ERK1/2及Cx43的表达及分布：将心肌组织切片置于68℃烤箱中烤60 min后行免疫组化染色，光镜下观察染色及HSP70、p-ERK1/2及Cx43分布情况，每张切片中各取4个非重叠无血管视野（×400），利用Image-Proplus 5.0图像扫描软件进行图像分析，测定每个视野下阳性物质的平均光密度值=累积光密度值/面积。

统计学方法：采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有数据以表示，单因素方差分析用于组间比较，LSD法用于两两比较，并采用Pearson相关性检验进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组大鼠心肌组织伊红素染色结果：图中心肌组织的细胞核被染成蓝色， 细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞均呈红色。对照组与干预组心肌纤维清晰，排列规则，无明显纤维化；而模型组、槲皮素组肌纤维排列紊乱、细胞外间隙增宽，部分心肌纤维扭曲肿胀、肌浆溶解、纤维断裂，纤维化程度明显。图1

各组大鼠心肌组织Masson染色结果：图中绿色部分代表心肌间质胶原成分，细胞质、心肌纤维和红细胞被染成深浅不一的红色，细胞核则被染成蓝色。心肌CVF干预组 [（9.235±1.302）%]与对照组[（8.140±0.970）%]比较，心肌纤维化差异无统计学意义（P＞0.05）；干预组与槲皮素组[（27.361±8.536）%] 、模型组[（29.352±8.726）%]比较， 心肌纤维化均减弱，差异有统计学意义（P均＜ 0.01）。图2

图1 各组大鼠心肌组织伊红素染色结果（×400）

图2 各组大鼠心肌组织Masson染色结果（×400）

各组大鼠心肌细胞中HSP70的分布及含量：正常心肌细胞的HSP70分布于心肌细胞胞浆中，免疫组化染色阳性呈棕黄色。免疫组化染色结果干预组大鼠心肌细胞HSP70的含量（0.321±0.047）较对照组（0.162±0.021）、模型组（0.167±0.013）、槲皮素组（0.169±0.024）均增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。（图3中HSP70 -3A、3B、3C、3D）

大鼠心肌细胞中p-ERK1/2的分布及含量：正常心肌细胞的和p-ERK1/2分布于心肌细胞胞浆中，免疫组化染色阳性呈棕黄色。大鼠心肌细胞中p-ERK1/2的含量，干预组与对照组比较[（0.195±0.022）vs （0.181±0.041） ]，差异无统计学意义（P＞0.05）；干预组较模型组 （0.387±0.088）、槲皮素组（0.350 ±0.067）均降低，且差异有统计学意义（P＜0.01）；而模型组、槲皮素组中其含量差异无统计学意义（P＞0.01）。（图3中p-ERK1/2 -3A、3B、3C、3D）

大鼠心肌细胞中Cx43的分布及含量：正常心肌细胞的Cx43线性规律分布于心肌细胞闰盘处，免疫组化染色阳性呈棕黄色。大鼠心肌细胞中Cx43的含量，干预组与对照组比较[（0.258±0.072）vs（0.301±0.082） ]，差异无统计学意义（ P＞ 0.05），且呈线性分布于心肌细胞闰盘处仅少量分布于心肌细胞侧面；干预组较模型组（0.147±0.021）、槲皮素组（0.162±0.028）组均增加，差异有统计学意义（P＜0.01），分布无规律且侧面分布相对增加；模型组与槲皮素组大鼠心肌细胞中Cx43的表达量无明显差异（P＞0.05）。（图3中 Cx43 -3A、3B、3C、3D）

图3 各组大鼠心肌细胞中HSP70、p-ERK1/2、Cx43免疫组化染色结果（×400）

p-ERK1/2的含量与心肌纤维化程度、Cx43含量的Pearson相关性分析结果：p-ERK1/2的含量与心肌纤维化程度呈正相关（r=0.978， P＜0.01）；而p-ERK1/2与Cx43含量含量呈负相关（R=-0.795， P＜0.01）。

3 讨论

心肌梗死后心室重塑是慢性心力衰竭的重要环节，而心肌纤维化和Cx43重构是心室重塑的重要表现形式。心肌纤维化可导致心脏舒张、收缩功能障碍，还可导致心肌心律失常发生[1-3]。Cx43表达量减少、非均匀化及侧面化被认为是Cx43重构的表现形式。Cx43表达量的减少和非均匀化可改变电传导的同向性，使电传导速率降低，且易形成折返，造成心律失常，而其侧面化，可引起延迟后去极化[15,16]，病理条件下心肌Cx43的这些重塑，是构成心律失常的基础之一。

本实验中大鼠大剂量皮下注射ISO 7d后发现，与对照组相比，模型组出现明显的心肌纤维化，Cx43表达量减少、且出现非均匀化及侧面化，与李玉光等[17]、林吉进等[18]研究结果相符。而且模型组p-ERK1/2的表达也较对照组增加，表明注射ISO后， 细胞外信号调节激酶通路激活并参与大鼠心肌纤维化和Cx43重构，该研究结果与Sugden等[9]、张卫泽等[10]、Ruch等[11]研究结果相一致。干预组给予Ala-Gln腹腔注射后发现心肌组织表达HSP70显著高于其他各组，且与模型组相比较心肌纤维化程度和Cx43重构均减轻，而p-ERK1/2的表达却减少，提示谷氨酰胺对心肌缺血模型大鼠的心肌纤维化和Cx43重构具有保护作用且与抑制细胞外信号调节激酶通路有关。进一步研究发现槲皮素组使用了HSP70抑制剂后抑制了心肌组织中HSP70的表达，同时p-ERK1/2的表达水平升高，心肌纤维化程度和Cx43重构与模型组比较无明显差别，表明Ala-Gln对心肌缺血模型大鼠心肌纤维化和Cx重构的保护作用主要是通过诱导心肌组织HSP70表达、抑制细胞外信号调节激酶通路来实现的，使用抑制剂抑制了HSP70的表达，该保护作用也消失。

综上所述，Ala-Gln可通过诱导心肌组织中HSP70的表达而起到改善心肌缺血大鼠心肌纤维化和Cx43重构的作用，其机制可能与下调p-ERK1/2的表达，抑制细胞外信号调节激酶通路的激活有关。Ala-Gln已广泛应用于临床，具有肯定的安全性和有效性，故Ala-Gln诱导HSP70升高，用于防治心肌缺血患者心肌纤维化和Cx43的重构具有潜在临床价值。

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Effects of Ala-Gln on Myocardial Fibrosis and Connexin43 Remodeling in Experimental Rats’ Model

BAO Hong-gang, ZHANG Wei-ze, LI Tao, CHEN Yong-qing, MA Ling, JIA Jun-jie, XU Zhi-yong.
Department of Cardiology, The 322 Hospital of PLA, Datong (037000), Shanxi, China

ZHANG Wei-ze, Email: zhangzwz@medmail.com.cn

Objective: To investigate the effects of Ala-Gln induced heat shock protein 70 (HSP70) expression on myocardial fi brosis and connexin43 (Cx43) remodeling in experimental rats’ model.Methods: A total of 32 SPF male SD rats were randomly divided into 4 groups: ①Control group, ②Model group, the rats received isoprenaline (ISO) 5m/(kg.d), ③Intervention group, the rats received ISO + Ala-Gln 0.75mg/(kg.d), ④Quercetin group, the rats received ISO + quercetin 100mg/(kg.d) + Ala-Gln + DMSO. n=8 in each group. All animals were treated for 7 days and killed in 4 weeks for relevant examinations. HE and Masson staining was conducted to observe myocardial fi brosis, then calculate collagen volume fraction; immunohistochemistry was applied to measure myocardial HSP70 expression,extracellular signal regulated kinase (p-ERK1/2) and Cx43 distribution, then conduct semi-quantitative analysis by specif i c soft ware.Results: HE and Masson staining indicated that Control group had no obvious myocardial fi brosis, Model group and Quercetin group had obvious fi brosis, and Intervention group showed less fi brosis than the other 2 groups, all P＜0.01. The fibrosis level was similar between Intervention group and Control group, P＞0.05. The myocardial HSP70 expression was similar among Control, Model and Quercetin groups, P＞0.05, while HSP70 expression was signif i cantly higher in Intervention group than the other 3 groups, all P＜0.01. The myocardial p-ERK1/2 level was lower in Intervention group than Model and Quercetin groups, all P＜0.01. The myocardial Cx43 level was similar between Control group and Intervention group with linear distribution, while it was higher in Intervention group than Model and Quercetin groups with disordered distribution, all P＜0.01.Conclusion: Ala-Gln inducing the higher expression of HSP70, which may reduce myocardial fi brosis in experimental rats, it could be because of HSP70 down regulating p-ERK1/2 expression and inhibiting ERK signaling pathway.

Ala-Gln; Myocardial fi brosis; Connexin43; Extracellular signal-regulated kinase; Heat shock protein 70

2014-03-12）

（编辑：曹洪红）

037000 山西省大同市，中国人民解放军第322医院 心血管内科（鲍宏刚、贾俊杰、徐志勇）；兰州军区兰州总医院 心血管内科（张卫泽、李涛、陈永清、马凌）

鲍宏刚 主治医师 硕士 主要从事冠心病及心脏电生理研究 Email: baohonggang@163.com 通讯作者：张卫泽 Email: zhangzwz@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）12-1024-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014. 12.016

方法：32只SPF级雄性SD大鼠（200±20）g，按随机数字表法随机等分为4组：对照组、盐酸异丙肾上腺素（ISO）[5mg/（kg.d）]组（模型组）、ISO[5mg/（kg.d）]+Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]组（干预组）、ISO[5mg/（kg.d）]+槲皮素 [100mg/（kg.d）] +Ala-Gln [0.75mg/（kg.d）]+二甲基亚矾（DMSO）组（槲皮素组）。每组每天1次给予相应试剂， ISO 连续给药7d后停止，余处理继续至第4周时处死大鼠。伊红素（HE）、Masson染色法观察心肌纤维化情况并计算胶原容积分数；免疫组织化学法观察心肌组织中HSP70、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）及Cx43分布，并通过软件进行半定量分析。

结果：伊红素、Masson染色结果显示对照组无明显心肌纤维化，模型组和槲皮素组出现明显的纤维化，而干预组较模型组和槲皮素组心肌纤维化程度均减弱（P均＜0.01），干预组与对照组的心肌纤维化程度无明显差异（P＞0.05）。对照组、模型组、槲皮素组中HSP70的含量差异无统计学意义（P＞0.05），而干预组中HSP70的含量较上述各组明显升高,且差异有统计学意义（P均＜0.01）。心肌组织中p-ERK1/2的含量干预组较模型组、槲皮素组均降低，差异有统计学意义（P均＜0.01）。Cx43含量在对照组与干预组中差异无统计学意义且呈线性规律分布，干预组较模型组和槲皮素组均增加，差异有统计学意义（P均＜0.01），分布无规律性，且侧面分布相对增多。

结论：Ala-Gln诱导HSP70高表达可减轻ISO诱发的心肌缺血模型大鼠心肌纤维化程度和Cx43的重构，其机制可能与HSP70下调p-ERK1/2的表达，抑制细胞外信号调节激酶通路激活有关。