通心络减轻糖尿病心肌缺血/再灌注损伤与其改善内皮屏障功能有关*

齐康，蒋雷培，李向东，崔贺贺，金辰，李娜，李清，田夏秋，杨跃进

通心络减轻糖尿病心肌缺血/再灌注损伤与其改善内皮屏障功能有关*

齐康，蒋雷培，李向东，崔贺贺，金辰，李娜，李清，田夏秋，杨跃进

目的：探讨通心络对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的影响是否与调控内皮屏障功能有关。

心肌再灌注损伤；血管内皮钙黏蛋白；微血管通透性；通心络；2型糖尿病

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1020.)

再灌注治疗的时代遗留了微血管缺血/再灌注损伤的难题。糖尿病损伤微血管内皮，加重心肌再灌注损伤。研究发现通心络可增加心脏微血管内皮钙黏蛋白表达，减轻心脏无再流和梗死范围，因此通心络具有潜在的内皮屏障保护功能[1]。作为通心络主要有效成分之一的人参皂苷Rg1可减轻心肌缺血/再灌注损伤[2]。通心络是否通过改善内皮屏障功能保护糖尿病心肌再灌注损伤尚不清楚。本研究通过对比通心络和胰岛素的心肌保护作用，明确通心络对糖尿病心肌的保护作用和可能机制。

1 材料与方法

实验动物与分组： 实验时间自2013-12至2014-04。购自北京维通利华公司12周龄雄性Zucker糖尿病大鼠32只及Zucker非糖尿病大鼠8只，体质量（325±25）g。糖尿病大鼠随机分成4组（每组8只）：假手术组，模型组，胰岛素组，通心络组。8只非糖尿病大鼠作为对照组。模型组：结扎冠状动脉前降支45 min，再灌注3 h。通心络组：在结扎冠状动脉前降支前30 min，将通心络胶囊干粉（1.43 g生药/g干粉，由河北以岭药业提供）混于蒸馏水中并进行一次大鼠灌胃（5 mg/100 g体重，剂量依据通心络胶囊临床用量换算）。胰岛素组：在结扎冠状动脉前降支前30 min开始给予胰岛素（5 U/100 g体重）静脉注射，监测并维持血糖10 mmol/L。假手术组和对照组不给药。

急性心肌梗死及再灌注模型的建立:手术前1 h，以10%水合氯醛（2 mg/kg）腹腔注射麻醉Zucker大鼠，呼吸机辅助呼吸。分离右侧颈总动脉，进行血流动力学监测。开胸结扎冠状动脉前降支，阻断血流45 min，松开丝线再灌注3 h。假手术组只穿线不结扎。

血流动力学监测：结扎前和再灌注3 h时记录左心室舒张末压（LVEDP）和左心室内压最大收缩和舒张变化速率（+dP/dtmax和-dP/dtmin）。

动物处死、取材和梗死面积测定：再灌注3 h时，于原位重新结扎冠状动脉前降支，从左心耳注入2%伊文氏蓝（1 ml/kg）。10%氯化钾静脉注射后立即取出心脏，沿心脏长轴将心脏切成4～5片。将整个心肌片放入1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，37℃水浴15 min。测量左心室壁心肌面积、结扎区面积、梗死区面积。

微血管内皮屏障功能评价：按照Li等[3]的方法，利用酶标仪测定心肌组织萃取液异硫氰酸荧光素浓度。按照经典膜蛋白提取方法[4，5]，利用FOCUSTMGlobal Fractionation试剂盒进行膜蛋白提取，再通过蛋白印迹（Western blot）技术检测心肌结扎区胞浆聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）不溶性和可溶性血管内皮钙黏蛋白的表达量，并计算两者的比值对定位于胞膜的血管内皮钙黏蛋白水平进行定量评估。

统计分析：用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所有变量以表示。两组间比较用t检验。结扎区面积、梗死区面积及异硫氰酸荧光素浓度等变量采用单因素方差分析中的Duncan法进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组动物急性心肌梗死再灌注前后生化和血流动力学变化（表1）

心肌缺血前：各组间血流动力学各指标差异无统计学意义（P均＞0.05）。血糖模型组明显高于对照组,胰岛素组明显低于模型组及假手术组（P均＜0.01）。

再灌注3 h时：血糖模型组、通心络组均高于假手术组，胰岛素组低于假手术组及模型组，通心络组明显高于胰岛素组（P均＜0.01）。LVEDP模型组、胰岛素组、通心络组均高于假手术组，模型组高于对照组，胰岛素组、通心络组均低于模型组（P均＜0.01）。+dP/dtmax模型组显著低于假手术组，胰岛素组、通心络组均显著高于模型组（P均＜0.01）。- dP/dtmin模型组显著高于假手术组，胰岛素组、通心络组均显著低于模型组（P均＜0.01）。

2.2各组大鼠心肌梗死面积比较（表2）

各组间结扎区面积差异无统计学意义。模型组梗死面积明显大于对照组（P＜0.01）。胰岛素组和通心络组梗死面积显著小于模型组（P均＜0.01），而胰岛素组和通心络组梗死面积差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠急性心肌梗死再灌注前后生化和血流动力学参数(n=8，

表1 各组大鼠急性心肌梗死再灌注前后生化和血流动力学参数(n=8，

注：与假手术组比较**P＜0.01；与对照组比较△△P＜0.01；与模型组比较▲▲P＜0.01；与胰岛素组比较##P＜0.01。 LVEDP：左心室舒张末压 +dP/dtmax和-dP/dtmin：左心室内压最大收缩和舒张变化速率。1 mmHg=0.133 kPa

假手术组 对照组 模型组 胰岛素组 通心络组缺血前血糖 (mmol/L) 20.4±3.2 4.6±0.3 21.3±3.3△△ 10.2±1.9**▲▲ 21.6±3.1 LVEDP (mmHg) 4.5±1.1 4.6±1.3 4.5±1.2 4.1±1.1 4.5±1.2 +dP/dtmax(mmHg/s) 3998.1±152.3 3934.2±155.2 3957.3±165.3 3953.2±183.3 3923.1±167.4 -dP/dtmin(mmHg/s) -3746.4±175.4 -3795.5±189.4 -3802.4±183.3 -3805.3±181.2 -3738.4±180.3再灌注3 h时血糖 (mmol/L) 21.1±2.9 9.8±0.7 28.3±4.5**△△ 9.8±2.4**▲▲ 27.5±4.4**##LVEDP(mmHg) 7.3±1.2 16.7±1.1 19.9±1.4**△△ 12.4±1.2**▲▲ 12.6±1.3**▲▲+dP/dtmax(mmHg/s) 3359.2±167.2 2169.4±145.2 1952.3±138.4**△△ 3359.3±164.2▲▲ 3363.7±147.3▲▲-dP/dtmin(mmHg/s) -2167.3±183.5 -1599.3±175.8 -1240.3±167.6**△△ -2163.3±193.5▲▲ -2192.3±167.7▲▲

表2 各组大鼠结扎区和梗死区面积(n=8,%,

表2 各组大鼠结扎区和梗死区面积(n=8,%,

注：与对照组比较△△P＜0.01；与模型组比较▲▲P＜0.01。-：无

假手术组 对照组 模型组 胰岛素组 通心络组结扎区面积 - 40.8±1.4 40.3±1.2 41.7±1.1 42.0±1.2梗死面积 - 36.2±1.3 55.2±1.4△△36.8±1.2▲▲36.7±1.1▲▲

2.3各组大鼠心肌微血管通透性比较（表3）

模型组正常区异硫氰酸荧光素浓度略高于假手术组及对照组，但差异无统计学意义（P均＞0.05）。但模型组结扎区异硫氰酸荧光素浓度显著高于对照组（P＜0.05）。胰岛素组和通心络组结扎区异硫氰酸荧光素浓度显著低于模型组（P＜0.01），并且两组间异硫氰酸荧光素浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。胰岛素组和通心络组正常区异硫氰酸荧光素浓度与假手术组浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠正常区和结扎区异硫氰酸荧光素浓度的比较（ n=8,μ g/μl,

表3 各组大鼠正常区和结扎区异硫氰酸荧光素浓度的比较（ n=8,μ g/μl,

注：与假手术组比较**P＜0.01；与对照组比较△P＜0.05；与模型组比较▲▲P＜0.01。-：无

假手术组 对照组 模型组 胰岛素组 通心络组正常区 102.1±21.3 101.4±24.3 118.3±21.3 98.8±18.3 101.9±20.4结扎区 - 164.2±16.4 204.7±18.1**△ 114.5±21.6▲▲ 113.5±20.9▲▲

2.4通心络对大鼠血管内皮钙黏蛋白表达水平的影响（表4）

表4 各组大鼠结扎区或对照区血管内皮钙黏蛋白表达水平的比较（n=8,%,

表4 各组大鼠结扎区或对照区血管内皮钙黏蛋白表达水平的比较（n=8,%,

注：与假手术组比较*P＜0.05**P＜0.01；与对照组比较△P＜0.05△△P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.05

假手术组 对照组 模型组 胰岛素组 通心络组心肌结扎区胞膜 101.2±13.1 67.2±12.1 46.2±9.5**△ 84.2±6.4**▲ 83.5±6.7**▲心肌结扎区胞浆 100.4±14.3 146.3±21.4 165.2±29.4** 125.2±14.2*▲124.5±13.5▲胞膜/胞浆比值 101.1±12.2 46.2±6.4 28.3±4.5**△△ 66.2±7.6**▲ 67.3±6.4**▲

心肌结扎区胞膜(Triton X-100不溶性部分)血管内皮钙黏蛋白表达：模型组低于假手术组（P＜0.01），胰岛素组和通心络组也低于假手术组（P＜0.01），但两组均高于模型组（P＜0.05）。心肌结扎区胞浆（Triton X-100可溶性部分）血管内皮钙黏蛋白表达：模型组、胰岛素组均高于假手术组（P均＜0.01），胰岛素组和通心络组低于假手术组（P＜0.05）。胞膜/胞浆比值：模型组明显低于假手术组及对照组（P＜0.01），胰岛素组和通心络组明显高于模型组（P＜0.05），但低于假手术组（P＜0.01），并且胰岛素组和通心络组两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本实验结果显示：① Zucker糖尿病大鼠再灌注3 h后，出现明显的再灌注损伤，结扎区微血管通透性明显增大，胞浆血管内皮钙黏蛋白表达增高，而胞膜血管内皮钙黏蛋白表达降低。②胰岛素可明显缩小梗死面积，减轻了再灌注损伤，降低了胞浆血管内皮钙黏蛋白表达，增加了胞膜血管内皮钙黏蛋白表达水平。③通心络明显缩小梗死面积，减轻再灌注损伤，降低胞浆血管内皮钙黏蛋白表达，增加胞膜血管内皮钙黏蛋白表达水平。

Ruder等[6]利用磁共振技术证实心肌缺血/再灌注损伤区域与血管内皮通透性增加的区域相吻合，提示心肌再灌注损伤中存在着微血管屏障功能的破坏。本实验中我们观察到模型组心肌结扎区微血管的通透性与梗死面积呈明显正相关，提示心肌微血管屏障功能的破坏在糖尿病大鼠的心肌再灌注损伤中同样存在[3,7]。微血管内皮屏障作为防止血液中有害物质侵入心肌的第一道屏障，在再灌注损伤中可能具有重要意义。内皮屏障破坏所导致的心肌水肿和间质渗透压的升高将带来心肌血液灌注的进一步减少[3]。同时再灌注区微血管屏障的破坏促进了白细胞向心肌组织中的迁移和浸润，进一步加重心肌损伤[8]。因此，缺血区血流恢复后的内皮屏障障碍是引起再灌注损伤的可能机制。糖尿病作为心血管事件的公认危险因素，本身即可影响心脏微血管的构成，可能使合并再灌注损伤时微血管通透性进一步增加[9-11]。

血管内皮钙黏蛋白是构成心肌微血管屏障的重要结构[12]。其水平的变化常常影响屏障功能，尤其是其定位于胞膜上的水平。静息状态下，血管内皮钙黏蛋白和血管内皮生长因子受体-2结合形成复合体，是维持微血管完整性的关键。而当缺血时，二者解聚，血管内皮钙黏蛋白内化、降解，最终导致了细胞连接蛋白的松散。此外，血管内皮钙黏蛋白还通过与肌球蛋白轻链激酶和整合素等蛋白的互相协调，以及信号转导作用，调节内皮的通透性，维护血管完整性，并且发挥信号转导作用[13]。我们发现虽然模型中胞浆中的血管内皮钙黏蛋白的含量增加，而胞膜血管内皮钙黏蛋白的表达却降低，提示再灌注损伤时的微血管屏障破坏可能与血管内皮钙黏蛋白的功能不良相关。给予胰岛素或通心络治疗后，糖尿病大鼠心肌梗死面积明显下降，内皮屏障功能改善，再灌注损伤减轻，同时胞膜上的血管内皮钙黏蛋白水平增加，提示这两种治疗的心肌保护作用可能与血管内皮钙黏蛋白介导的心肌微血管内皮屏障功能的改善有关。

胰岛素可降低糖尿病大鼠的血糖，减轻心肌再灌注损伤。但心肌梗死时降糖治疗存在低血糖的风险，使胰岛素在急性心肌梗死时的临床应用存在局限性。本研究发现通心络减轻心肌再灌注损伤的作用不依赖于血糖降低，但心肌保护效果不亚于胰岛素降糖治疗。胰岛素和通心络均可明显减轻糖尿病大鼠结扎区心肌微血管通透性，胰岛素和通心络的保护作用与调控血管内皮钙黏蛋白在心脏微血管内皮细胞的表达和分布有关。

结论：通心络减轻心肌再灌注损伤与保护黏附连接介导的微血管内皮屏障功能有关，这一保护作用不依赖于降糖，并且不亚于胰岛素降糖治疗。

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Protection of Tongxinluo Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury Relates to Enhancing Endothelial Barrier in Diabetic Rats

QI Kang, JIANG Lei-pei, LI Xiang-dong, CUI He-he, JIN Chen, Li Na, Li Qing, TIAN Xia-qiu, YANG Yue-jin.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

YANG Yue-jin, Email: yangyjfw@126.com

Objective: To clarify that protection of Tongxinluo against myocardial ischemia/reperfusion injury relates to enhancing endothelial barrier in diabetic rats.Methods: A total of 32 Zucker diabetic rats were randomized into 4 groups: Sham group, Model group, Insulin group and Tongxinluo group, n=8 in each group. In addition, there was a Control group containing 8 non-diabetic Zucker rats. Myocardial ischemia/reperfusion injury model was established by a 45-min ischemia and 3-h reperfusion protocol. The size of infarction was detected by pathological staining, the microvascular permeability was examined by Miles assay to obtain the fl uorescein isothiocyanate concentration in myocardial tissue, the Triton X-100 soluble and insoluble VE-cadherin was measured by membrane protein extraction and western blot analysis.Results: The size of infarction in Model group was obviously higher than that in Control group (55.2 ± 1.4) % vs (36.2± 1.3) %, P＜0.05 and the fl uorescein isothiocyanate concentration was also higher in Model group than Control group. Both insulin group and Tongxinluo group had the similar size of infarction with Model group (36.8 ± 1.2) % vs (38.7 ± 1.1) %, P＞0.05. Both insulin group and Tongxinluo group got lower fl uorescein isothiocyanate concentration (all P＜0.01) and VE-cadherin internalization (all P＜0.05) than that in Model group.Conclusion: Protection of Tongxinluo against myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats is as effective asinsulin, but the effect is independent of reducing blood glucose and may be related to enhancing endothelial barrier.

Myocardial reperfusion injury; VE-cadherin; Microvascular permeability; Tongxinluo; Type 2 diabetes

2014-06-13）

（编辑: 王宝茹）

国家重点基础研究发展规划项目（项目编号：2012CB518602）资助 (973计划项目)；国家自然科学基金（项目编号：81370223）；北京协和医学院研究生创新基金项目（项目编号：2013-1002-39）

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 国家心血管病中心 阜外心血管病医院 心血管疾病国家重点实验室

齐康 住院医师 博士研究生 主要从事心血管病研究 Email: qikang1985@163.com 通讯作者：杨跃进 Email: yangyjfw@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1020-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.015

方法：将32只Zucker糖尿病大鼠随机分为假手术组，模型组，胰岛素组，通心络组，每组8只。8只Zucker非糖尿病大鼠作为对照组。通过进行心肌缺血45 min/再灌注3 h干预以建立心肌再灌注损伤模型。通过病理染色法测定心肌梗死面积。采用Miles法，通过酶标仪测定心肌组织萃取液异硫氰酸荧光素浓度，从而反映心肌微血管通透性。利用膜蛋白提取和蛋白印迹（Western blot） 技术检测聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）不溶性和可溶性血管内皮钙黏蛋白的表达量。

结果：模型组梗死面积显著高于对照组[（55.2±1.4）% vs （36.2±1.3）%，P＜0.05]，模型组异硫氰酸荧光素浓度和血管内皮钙黏蛋白内化显著高于对照组。胰岛素组和通心络组梗死面积均低于模型组[（36.8±1.2）% vs （38.7±1.1）%，P＞0.05]，胰岛素组和通心络组异硫氰酸荧光素浓度（P＜0.01）和血管内皮钙黏蛋白内化（P＜0.05）均明显低于模型组。

结论：通心络减轻心肌缺血/再灌注损伤与保护内皮屏障功能有关，这一保护作用不依赖于降糖治疗，并且不亚于胰岛素降糖治疗。