实时荧光定量PCR技术在乳品微生物学中的应用研究进展

朱军伟，杭 锋，王钦博，宋 馨，侯建平

(光明乳业股份有限公司，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436)

传统的定量检测方法依靠特定的微生物培养基对食品中活菌进行分离和计数，测试过程需进行培养基准备、平板培养、菌落计数、生化鉴定等步骤，所以整个检测显得复杂、费时［1-2］。当前食品中病原菌的分子生物学检测方法已极大缩短了获得检测结果的时间，这既能保证食品工业的产能提速，同时又能保持其所有食品安全要求。如今，基于聚合酶链反应方法检测食源性微生物病原菌已经获得了国际标准化组织(ISO)认可［3-5］。

传统的微生物方法无法检测一些有活性但很难培养的微生物，而分子生物学方法却能实现。此外，最新的分子生物学方法利用荧光染料特异性掺入DNA双链，可以准确地计算活性微生物菌群的数量。

在乳品工业中，微生物技术常被应用于食源性病原菌的检测和有益微生物如发酵微生物、益生菌的定量。由于益生菌和乳酸菌在乳制品中同时存在，如何准确地计数每种益生菌和乳酸菌的数量给乳品工业带来了一个巨大挑战。乳品微生物学需要具有高鉴别能力的方法，进而量化诸如乳制品和粪便等复杂系统中的益生菌数量，并追踪其在食物链中存活能力的相关信息。因此，国内外研究人员正在研究基于PCR的分子学方法以期能准确定量活菌数量，还可以在单一反应体系中检测多个微生物数量，且能构建高通量PCR流程［6-8］。目前，该方法已经取得了一些进展，笔者就实时荧光定量PCR技术在乳品微生物学中的最新研究进行了综述，并对其作用机理进行阐述，期望能给实时荧光定量PCR技术在乳品工业中的推广使用提供一定的理论支持。

1 实时荧光定量PCR概述

1.1 实时荧光定量PCR的基本原理 实时荧光定量PCR(real-time fluomgenetic quantitative PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团(染料或探针)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法［8-10］。

荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针是在探针的5＇端标记一个荧光报告基团(R)，3＇端标记一个淬灭基团(Q)，两者可构成能量传递结构，即5＇端荧光报告基团所发出的荧光可被3＇端淬灭基团吸收或抑制，当两者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，荧光监测系统可收到荧光信号。

定量的原理:靶基因初始拷贝数越多，所产生的循环阈值(cycle threshold，CT)越小。这里有2个问题需要明确:①荧光阈值的设定。在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。②CT值为PCR过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数。根据荧光产生的原理，可将实时荧光定量PCR分为不同类型［9-10］(表1)。

1.2 实时荧光定量PCR的特点 实时荧光定量PCR技术与传统定量PCR技术相比，具有以下优点［11］:①实时定量PCR不需要PCR后处理，所以可避免PCR的实验室污染，大大减少因交叉污染引起的假阳性错误。②可用β-actin基因序列对样本的扩增效率进行标化。在产物积聚的对数期进行实时分析，允许对多种不同的基因进行同时分析，而不必考虑“平台效应”对试验结果的影响。③节省了PCR后处理的时间，样本通量大大提高。④实时定量PCR无需内标，具有高度重复性，可对每个样本进行重复扩增以减少潜在错误。⑤实时定量PCR有很大的动力学范围(接近1×106)，用标准曲线对靶序列进行检测时，可对任何未知样本进行定量，循环阈值(threshold cycle，Ct)和相关的DNA模板拷贝数呈线性相关。

另外，实时定量PCR技术有效地解决了传统定量PCR只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在计算机软件之中，通过对每个样品循环阈值的计算，根据标准曲线获得定量结果［12-16］。

表1 实时荧光定量PCR技术分类

2 实时荧光定量PCR在乳品微生物学中的应用研究进展

2.1 实时荧光定量PCR在益生菌检测中的应用 根据世界卫生组织(WHO)对益生菌的定义［17］，它是指一类活的微生物，当摄入一定数量时，对宿主的健康有益。益生菌对宿主健康的积极作用还和其应用剂量紧密相关。宿主体内益生菌数量极其重要，那么要保证其剂量，就需要保证产品货架期内益生菌的存活数量及其在宿主肠道内的存活量;与此同时，益生菌也可在宿主回肠末端或大肠中自行繁殖到足够剂量，从而发挥益生作用。

几项研究结果表明，使用一些发酵微生物作为发酵乳中的益生菌在预防和治疗某些疾病方面呈现出显著有益的临床效应。Heyman等研究表明，益生菌对于预防和治疗腹泻效果明显［18］。Mustapha等研究表明，益生菌的存在可以改善乳糖不耐症患者对于乳糖的消化［19］。益生菌在预防和治疗过敏性、炎症性肠病中能发挥积极作用［20-21］。

益生菌鉴定和计数的传统方法是通过生化、形态学及选择性培养等方法进而区分不同益生菌的表型特征［22］。

随着双歧杆菌在益生菌产品中的广泛使用，建立一种快速的定性且定量检测市售产品中双歧杆菌的方法显得极其重要。最新的一些研究成果表明，实时荧光定量PCR技术为乳品中发酵微生物和益生菌的定量检测提供了全新的方法，从而减少检测时间与劳力消耗［23］。

王立平等建立了发酵乳制品中双歧杆菌种类和数量快速测定方法［24］。以发酵乳中双歧杆菌为靶标，采用PCRDGGE技术快速识别双歧杆菌种类;采用实时荧光定量PCR手段测定双歧杆菌数量。研究结果表明，PCR-DGGE能准确、快速鉴别双歧杆菌种类，检出限为105CFU/g;实时荧光定量PCR能准确、快速定量双歧杆菌，检出限为104CFU/g。该方法可用于发酵乳中双歧杆菌的快速识别和定量。

Masco等以16s rDNA或recA为目标基因分别设计引物，再进行实时荧光定量PCR分析，对29种益生菌产品中的双歧杆菌进行了定量检测［25］。2种实时定量PCR方法都很快速，且定量结果都很相近，只有在检测含益生菌较少的产品时，以16s rDNA为目标基因的定量更为灵敏。

Sheu等以tuf为目标基因设计引物进行实时PCR反应，能有效地检测到益生菌产品中的双歧杆菌;此外，还能检测到存活的双歧杆菌数量以及原有双歧杆菌总数量，与平板计数法所得数目基本一致［26］。此研究为检查益生菌产品的质量提供了一种行之有效的方法。

Herbel等以hsp60为目标基因设计引物建立实时荧光定量PCR流程以检测酸奶中5种重要的益生乳杆菌属［27］。通过此法的最低检测限为105CFU/ml，这对于市售酸奶制品来说已经是相当高效。因此，通过合理设计引物建立实时荧光定量PCR可以更准确、快速和灵敏地检测和定量市售产品中益生菌含量。

García等建立了一种核酸染料 propidium monoazide(PMA)与定量PCR技术联合选择性检测发酵乳制品中活性乳酸菌和双歧杆菌的技术(PMA-qPCR)［28］。结果表明，PMA-qPCR技术既能够有效区分活性菌与非活性菌，又能区别活性乳酸菌和活性双歧杆菌，同时还能快速有效地计数2种活性菌的数量。与平板计数法相比，检测时间由72 h缩短至3 h左右。

Desfossés等首度通过PMA-qPCR技术监测切达干酪制作以及成熟过程中益生菌菌群(主要分析植物乳杆菌和双歧杆菌)的存活性能［29］。结果表明，与传统分子技术相比，PMA-qPCR技术更具特异性和准确性。

因此，PMA-qPCR技术在发酵乳制品或者干酪中益生菌的鉴定和定量中具有广阔的应用前景。

2.2 实时荧光定量PCR在发酵乳制品乳酸菌检测中的应用 Sheu等通过tuf基因设计引物开发了多重非定量PCR技术，可以用于同时检测市售乳制品中嗜乳酸杆菌、干酪乳杆菌群、德氏乳杆菌以及长双歧杆菌［30］。然而，很少有研究报道如何既能检测乳制品中乳酸菌又能对其进行定量。

Furet等开发并评估了一种实时荧光定量PCR技术应用于特异性检测和定量市售发酵乳制品中乳酸菌菌群(嗜热链球菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、约氏乳酸杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)的数量，并与传统平板计数法进行比较［31］。结果表明，实时荧光定量PCR不仅可以鉴定发酵乳制品原有的乳酸菌菌群种类，还可以准确地定量各不同菌群的菌体数量。

吴荣荣等采用实时荧光定量PCR分析了酸乳中的德氏乳杆菌L2和嗜热链球菌S1的数量［32］，德氏乳杆菌L2的活菌数与细胞循环数的相互关系曲线为Y=-2.936logX+34.72(R2=0.998)，采用平板计数法获得的样品中L2浓度为8.82×108ml，荧光定量的结果是8.78×108ml;嗜热链球菌S1活菌数与细胞循环数的相互关系曲线为Y=-3.039logX+35.45(R2=0.995)，采用平板计数法，获得的样品中嗜热链球菌S1浓度1.08×108ml，荧光定量的结果是1.06×108ml。实时荧光定量的方法适合于酸乳中乳酸菌的快速计数。

2.3 实时荧光定量PCR在干酪制品微生物检测中的应用 在干酪的成熟过程中，参与发酵过程的有益微生物对于最终成品干酪的风味品质尤为重要。由于缺少可供选择的媒介，量化干酪表面的细菌非常困难，因此干酪表面的微生物菌群生态系统还得不到广泛研究。

Monnet等开发了SYBR Green I实时荧光PCR方法用来定量市售涂抹型干酪上的干酪棒状杆菌［33］。此方法有助于研究涂抹型干酪的生态系统以及干酪棒状杆菌的功能特性。

卡门培尔青霉和娄地青霉在霉菌表面成熟干酪和蓝纹干酪的成熟过程中起到了至关重要的作用。G.Le Dréan等开发了qRT-PCR技术，为干酪生产厂家提供了一种简便且灵敏的检测方法，即通过卡门培尔青霉和娄地青霉的成长动力学，进而很好地理解微生物变化与生物化学变化两者之间的关系［34］。

Ladero等利用高效液相色谱法(HPLC)和实时荧光定量PCR技术对不同市售干酪中组胺及组胺产生的细菌含量分别进行了分析测定［35］。即使在干酪的生产过程中，利用实时荧光定量PCR技术可以在组胺水平积累到不可接受程度之前检测到组胺产生菌株的含量，这就能有效解决高效液相色谱法只能检测干酪中组胺含量而不能检测产生组胺的细菌数量的问题。

Achilleos等以tuf为目标基因开发了2种实时荧光定量PCR方法来定量研究干酪样品中乳酸乳球菌和副干酪乳杆菌2种菌群的数量［36］。结果表明，此方法能极为有效地定量干酪中乳酸乳球菌菌群的数量，而对于副干酪乳杆菌菌群的计数却无法达到理想效果。

Zago等以pheS为目标基因开发了一种实时荧光定量PCR方法来特异性检测定量干酪中的一类有益微生物——灰黄色肠球菌(Enterococcus gilvus)，其检测限可达到104CFU/g［37］。此方法有助于检测和定量干酪中的灰黄色肠球菌，进而更好地理解其在干酪以及其他发酵食品中所起到的技术作用和安全性作用。

Martín等以 lacZ为目标基因设计引物，基于 SYBR Green I建立实时荧光定量PCR流程来定量检测干酪中的所有大肠菌群，且整个流程仅需花费10～12 h［38］。

3 小结与展望

该研究中所提到的大多数研究案例以及最新的研究进展说明实时荧光定量PCR技术在乳品微生物学中的应用才刚刚起步，许多国内外学者正致力于其广泛应用。未来在这一领域的发展是希望通过此技术能够给乳品工业化过程中微生物风险评估提供有利的信息。当然，实时荧光定量PCR技术的发展，不能与其他传统和分子学方法相脱离，而应该与他们结合起来以实现优势互补。

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