含人FABP4基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及鉴定

（暨南大学血液病研究所，广州510632）

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含人FABP4基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及鉴定

朱锦灿，陈小宇，祝爱珍，刘成成，刘善淘，刘革修

（暨南大学血液病研究所，广州510632）

目的构建含有人脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（FABP4）基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic-FABP4-promoter，为脂类代谢相关药物研究提供基础。方法根据已知人的FABP4基因启动子序列设计引物，以人DNA为模板，用PCR法扩增出人FABP4基因启动子的DNA大片段。经过限制性内切酶KpnI和XhoI双酶切后插入到pGL3-Basic载体中；测序鉴定；然后将这些重组质粒瞬时转染到K293细胞中，并在24 h后检测其荧光素酶活性。结果构建的含荧光素酶基因的质粒，经酶切及测序鉴定结果显示FABP4启动子插入的位置和序列正确。转染细胞后检测其荧光显示：重组pGL3质粒转录活性较pGL3-Basic质粒明显增强（P＜0.001）。结论成功构建了pGL3-Basic-FABP4-promoter质粒，为进一步研究FABP4基因的表达调控提供了工具和基础。

FABP4；启动子；荧光素酶；质粒；转染

脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding proteins，FABPs）是细胞质内一类相对低分子质量蛋白［1］。FABPs可以结合多种配体，主要作用是转运脂类或参与脂类代谢，调整游离配体浓度，直接或间接参与多种细胞调节过程。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty-acid binding protein，FABP4），也称为Ap2、ALBP或A-FABP，主要在脂肪细胞中表达，在甘油三酯形成及脂解过程中参与调控脂生成或溶解的生化过程［2］。近年来FABP4被证明与糖尿病、心血管动脉粥样硬化症等疾病密切相关［3］。因此本研究通过构建人FABP4基因启动子荧光素酶报告基因质粒（pGL3-Basic-FABP4-promoter），建立报告基因转录调控体系，以期了解影响脂类代谢相关药物对其启动子转录活性的调控，为深入研究相关疾病提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

pGL-3basic载体、Wizard®基因组DNA纯化试剂盒、质粒提取、纯化试剂盒购自Promega公司；T4 DNA Ligase酶、dNTPs、限制性内切酶KpnI、XhoI购于TaKaRa公司；KOD plus neo DNA Polymerase购于ToYoBo公司。E.coli DH5α菌株、K293细胞株由暨南大学血液病研究所保存，DNA凝胶回收试剂盒购自州东盛生物科技有限公司；转染脂质体Lipo-

fectamine2000购自Invirtogen公司；胎牛血清、RPMI1640、胰酶培养基购自于美国GIBCO公司产品。

1.2 基因组模板的制备

根据Wizard®基因组DNA纯化试剂盒操作方法提取人细胞基因组DNA，接着通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度及完整性，置于-20°C备用。

1.3 PCR引物的设计

根据GenBank收录的FABP4启动子基因序列，用Primer 5.0软件自行设计出引物。其序列如下：上游为5′-CGGGGTACCCATTCAGAAAGGAACTTT GTTTCAAATAA-3′，含KpnI酶切位点；下游为5′-CCGCTCGAGATTATTCTTCAAGGTGAGAAGGAAG CTG-3′，含XhoI酶切位点。引物由苏州金唯智公司合成。

1.4 启动子片段的克隆

以人细胞基因组DNA为模板。根据上述引物，利用PCR扩增仪进行扩增；反应条件：94℃变性5 min；98℃30 s，58℃30 s，68℃2 min 40 s，共30个循环；68℃延伸5 min。获得一段长5 467 bp的PCR扩增产物。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳获得分离条带，参照DNA凝胶回收试剂盒的操作说明回收目的DNA片段。

1.5 pGL3-Basic-FABP4-promoter质粒构建及鉴定

用限制性内切酶KpnI与XhoI双酶切含FABP4启动子PCR回收产物及pGL-3basic载体。酶切产物经1%凝胶电泳后，回收酶切产物。将酶切回收PCR产物及载体于0.2 mL EP管中16°C连接2 h。连接产物转化DH5α感受态细胞，于含氨苄青霉素的LB培养基中选择培养。筛选阳性克隆，将所选阳性克隆进行扩增。并通过高纯度少量提试剂盒提取质粒进行XhoI单酶切鉴定，鉴定正确的克隆送华大基因公司测序验证。

1.6 细胞转染及荧光素酶活性的检测

K293细胞被培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中（37℃、5%CO2）。在转染前将5×105个细胞接种于24孔培养板中。分别以正常K293细胞为对照组；转染空质粒pGL3-Basic的K293细胞为阴性对照组。转染pGL3-Basic-FABP4-promoter重组质粒的K293细胞为转染组。根据Lipofectamin 2000转染试剂盒说明书操作方法将pGL3-Basic-FABP4-promoter导入K293细胞。转染K293细胞24 h后裂解细胞，按照荧光素酶检测试剂盒的操作说明，在TD20/20荧光照度计上测定荧光值。

1.7 统计学处理

计量资料采用x±s表示，采用SPSS 13.0统计分析软件，采用两独立样本的t检验。以P＜0.05作为统计学显著性差异标准。

2 结果

2.1 基因组DNA的PCR产物电泳

基因组DNA的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳结果如图1。在20 kb以上出现有1条扩增条带，未出现弥散条带。

图1 基因组DNA的PCR产物图Fig.1 PCR results of genomic DNA

2.2 FABP4启动子扩增结果

FABP4启动子PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳结果如图2所示。在5 kb和6 kb之间出现一条清晰的扩增条带，与目的基因片段大小一致。

图2 FABP4启动子PCR产物电泳图Fig.2 PCR results of FABP4promoter

2.3 重组质粒酶切鉴定

经质粒提取后进行单酶切XhoI鉴定，酶切产物

于含溴化乙锭（EB）的1%琼脂糖凝胶上电泳，UVP凝胶成像系统成像结果如图3所示。图3中，FABP4（5 467 bp）在相应的位置切出一条目的条带（泳道10），说明筛到的2个克隆均为阳性克隆。可选取作该阳性号质粒去测序。

图3 FABP4启动子与pGL⁃3basic载体连接产物的酶切鉴定Fig.3 Identification of pGL3⁃FABP4 plasmid after digestion.

2.4 测序结果

酶切产物经华大基因公司测序。测序结果经Blast比对，结果与NCBI上已知序列进行BLAST 99%一致，证实含FABP4启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。

2.5 荧光检测结果

荧光检测结果如图4所示。阴性对照组的K293细胞裂解液萤火虫荧光值低，对照组组的K293细胞裂解液几乎检测不到荧光。然而转染了pGL3-FABP4-promoter重组质粒的转染组K293细胞裂解液荧光值明显高于对照组及阴性对照组，差异有统计学意义。说明FABP4启动子准确插入到了荧光酶基因上游，并对荧光酶基因的表达起到正调控作用。

图4 不同质粒转染K293细胞后的相对荧光素酶活性Fig.4 Relative luciferase activity after the K293 cells were transfected with different plasmids

3 讨论

FABP4属于FBBPs家族中的一员，定位于人类8q21染色体区域，含有4个外显子和3个内含子，编码132个氨基酸，相对分子质量为14 588。其蛋白结构由N端的2个α螺旋和10个β折叠组成并以螺旋-卷曲-螺旋的结构域作为帽子覆盖顶部，形成一个配体结合口袋［4］。

研究发现，作为脂类的分子伴侣，FABP4在成熟的脂肪细胞中可占到总蛋白的6%［5］，是脂肪细胞分化晚期表达上调的重要蛋白之一。发现于脂肪细胞［6］及脂肪组织［7］中，并且在巨噬细胞［8］和单核来源的树突状细胞［9］中也有表达。大量动物实验和临床资料表明：FABP4水平与多种疾病密切相关，例如FABP4缺陷或给予FABP4抑制剂的小鼠胰岛素敏感性提高［10，11］，究其原因为FABP4作为脂肪酸的转运蛋白，影响着脂肪酸的代谢及脂肪酸信号，从而与糖尿病和动脉粥样硬化密切相关。另有研究发现使用FABP4抑制剂干预遗传和高脂饮食诱导的肥胖小鼠后可改善糖代谢，增加胰岛素敏感性，可有效的治疗患有严重动脉粥样硬化和糖尿病的小鼠模型［12］。除此以外，FABP4还跟冠心病、非酒精性脂肪肝等有关［13，14］。

本实验成功克隆了FABP4启动子区的基因序列，并构建了荧火虫荧光素酶表达质粒pGL3-FABP4-promoter，通过脂质体成功转染了K293细胞，转染后24 h进行荧光素酶检测发现：转染了pGL3-basic空白质粒的对照组没有荧光素酶报告基因的转录活性；而转染了pGL3-FABP4-promoter重组质粒的实验组能观察到有显著的转录活性，表明FABP4启动子的活性驱动了荧光素酶的表达，证明了本研究构建的重组FABP4启动子片段有良好的启动活性。

综上所述，本研究建立了FABP4启动子荧光素酶报告基因重组质粒，可用于对FABP4启动子的进一步研究中。为以后构建通过检测FABP4启动子活性筛选FABP4抑制剂的方法提供实验基础，以达达到治疗FABP4相关疾病的目的。

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（编辑 裘孝琦）

Construction ofpGL3-basic-FABP4-promoter Reporter Gene Vector and Detection ofIts Function

ZHUJin-can，CHEN Xiao-yu，ZHUAi-zhen，LIUCheng-cheng，LIUShan-Tao，LIUGe-xiu
（Institute ofHematology，SchoolofMedicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

ObjectiveTo constructan FABP4promoterrecombined luciferase reportergene vector，and to detectits function，thus providing a basis for the research on lipid metabolism related medicines.MethodsPrimers were designed based on human FABP4gene promoters，and FABP4 promoters from human genome DNA was replicated by PCR.Then FABP4promoters were inserted into the pGL3-basic vectorafterdouble digestion by restriction enzyme KpnI and XhoI.Positive clones were identified by sequencing.The recombinant pGL3-basic-FABP4-promoter vector were transiently transfected into K293 cells.After 24 hours，the activity of luciferase was detected.ResultsA pGL3 luciferase reporter vector was constructed.The result of sequencing and double digesting of recombined plasmid were completely correct.The results of luciferase detection after transfection showed that the transcriptional activity of recombinant pGL3 plasmid was obviously increased compared with that of pGL3-basic plasmid（P＜0.001）.ConclusionA pGL3 luciferase reporter vector containing human FABP4promoter gene was constructed successfully，which provides a tooland basisforfurtherstudy of FABP4gene expression regulation.

FABP4；promoter；luciferase；plasmid；transfection

Q782

A

0258-4646（2014）02-0166-04

国家自然基金（81270568）

朱锦灿（1987-），男，硕士研究生.

刘革修，E-mail：tliugx@jnu.edu.cn

2013-10-15

网络出版时间：