牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆理化特性的研究

2014-02-28 11:58李贵节
食品工业科技 2014年10期
关键词:黄素保加利亚菌种

赵 欣,李贵节

(重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆400067)

牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆理化特性的研究

赵 欣,李贵节*

(重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆400067)

探讨了牦牛酸乳分离乳杆菌(LFYY)发酵豆浆的理化性质。LFYY在人工胃液中存活率和在胆盐中的生长率为保加利亚乳杆菌(LB)的大约4倍和7倍。在6h和12h发酵后,LFYY发酵豆浆的pH高于混合菌(LM,LFYY∶LB=1∶1)发酵豆浆,LB发酵豆浆为最低。这些发酵豆浆的酸度呈现和pH相反的趋势。当发酵到6h和12h时,LM发酵豆浆中的总菌数高于LFYY和LB发酵豆浆。LFYY发酵豆浆中的氨基酸态氮和活性大豆异黄酮(大豆黄素和金雀异黄素)接近于LM发酵豆浆,显著高于LB发酵豆浆(p<0.05)。LFYY和LM发酵豆浆的感官品质也优于LB发酵豆浆。从实验结果可以看出,LFYY发酵豆浆的品质优于LB发酵豆浆,混合菌可以提高发酵豆浆的品质,牦牛酸乳分离乳杆菌有利于发酵豆浆的生产。

豆浆,牦牛酸乳分离乳杆菌,氨基酸态氮,大豆异黄酮

乳杆菌作为细菌的一科,已经被广泛应用在食品工业中,除了我国传统的食品,如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等的生产技术外,酸乳这一深入人们生活的食品也是利用杆菌进行生产制作的[1-2]。我国工业中生产酸乳所用的发酵菌绝大部分是来自于国外,现在已经逐步对我国传统酸乳制品中的微生物进行分离利用,乳杆菌作为发酵酸乳中常见的菌种,现已有部分乳杆菌从我国传统酸乳中被分离出来[3]。大豆中蛋白质含量高,含有钙、铁、锌等微量元素,同时发酵豆浆中的乳酸菌能抑制肠道中腐败菌的生长和繁殖,能调节肠道功能正常活动[4]。而筛选生长繁殖力强、耐酸性好、发酵活力高的优质乳酸菌能进一步加强发酵豆浆的营养价值,增强其品质[5]。

牦牛乳具有营养成分含量高的特性,被视为“天然浓缩乳”,是川藏高原地区人民的一种重要的食品[6]。利用牦牛乳的优质品质,采用川西牧区高海拔,气温低,温差大,紫外线辐射强的特殊生态环境生产的牦牛酸乳也具有很高的品质,并且分离出的微生物也具有特定的性质,区别于同类的一般微生物[7-8]。本研究选用来自四川阿坝藏族羌族自治州的红原县牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳中分离鉴定的一种乳杆菌为对象,同时选取工业上常用的保加利亚乳杆菌作为对照菌株,利用两种菌种生产发酵豆浆,制成牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆,保加利亚乳杆菌发酵豆浆。同时为了更好地了解两种菌种的发酵能力,采用平均混合的方式(1∶1混合),使两种菌在数量相等的基础上混合发酵豆浆,作为对照样品和前两种豆浆进行对比。分析三种发酵豆浆的理化特性,为充分利用牦牛酸乳中分离微生物运用到工业生产中打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆浆 选用黑龙江农垦总局2012年产优质黄豆,用凉水浸泡12h打浆后用纱布过滤后得发酵前豆浆原汁;保加利亚乳杆菌 购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心;分离乳杆菌 四川阿坝藏族羌族自治州的红原县自然发酵牦牛酸乳中分离鉴定的一种耐酸性最强的乳杆菌;甲醇(色谱纯)、无水乙醇(分析纯) 重庆市品誉化工有限公司;MRS培养基 上海艾研生物科技有限公司;大豆黄素、金雀异黄素标准品 美国Sigma公司。

LS-B75L型高压蒸气灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司;WPL-30型恒温培养箱 江东精密仪器有限公司;MeterLab PHM210型pH计 法国Radiometer-Analytical SAS公司;VS-15CFN型离心机 韩国Vision科学株式会社;UV-1750型紫外分光光度计 日本岛津公司;Waters 2487型高压液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种耐受人工胃液的测定 将0.2%的NaCl、0.35%的胃蛋白酶溶解与1mol/L HCl混合后调整pH到3.0配制成人工胃液,灭菌后备用。取5mL菌株培养液,倒入已灭菌10mL离心管中,3000r/min离心10min后收集菌体,再加入5mL灭菌生理盐水混合均匀配制成菌悬液,取配制好的菌悬液1mL与9mL的人工胃液混合,摇匀,置于恒温振荡器中培养(37℃,300r/min),并分别在0h和3h取样,用MRS琼脂培养基倾注37℃培养48h[9]。用平板计数法测定活菌数,按公式:存活率(%)=测定活菌数/0h的活菌数×100,计算其存活率。

1.2.2 菌种耐受胆盐的测定 将菌种5mL按2%的接种量分别接种于含0.0%的Oxgll和1.0%的Oxgll(W/V)的MRS-THIO培养基(MRS培养基中加0.2%的巯基乙酸钠)。在恒温振荡器中37℃培养24h后,以空白培养基为对照(未接种的MRS-THIO培养基),在600nm处分别测定上述不同浓度培养基的OD值[9],按公式:胆盐耐受力(%)=含胆盐的培养基的OD值/空白培养基的OD值×100,计算菌株对胆盐的耐受力。

1.2.3 pH和总酸度的测定 用pH计测定发酵豆浆的pH。取发酵豆浆20mL后用0.1mol/L NaOH滴定至pH=8.3,计算样品的总酸度。公式如下:

酸度=V1×C×0.09×100/V2

式中∶C为滴定NaOH的浓度(0.1mol/L);V1为滴定用NaOH的量(mL);V2为样品量(mL)。

1.2.4 活菌数测定 在发酵进行到6、12h时吸取发酵豆浆,梯度稀释后选取稀释106倍的菌液与MRS培养基混合均匀后倾注平板,分别测定各组菌落形成单位(CFU/mL)。

1.2.5 氨基酸态氮的测定 取样品20mL采用甲醛值法进行氨基酸态氮含量的测定[10]。

1.2.6 活性异黄酮含量的测定 以Kromasil C18色谱柱(4.6mm×25mm,5μm);流动相∶40%甲醇;流速为1.0mL/min;检测器灵敏度为0.02AUFS;检测波长为260nm;柱温为50℃;进样量为20μL的色谱条件进行测定。分别将大豆黄素和金雀异黄素标准品用80%(V/V)乙醇溶解,配制成浓度为0.002~0.020g/L标准溶液。取标准溶液20μL注入六通阀中,测定峰面积。求得回归方程为:Y大豆黄素=148338+1.70×108X(r= 0.999);Y金雀异黄素=-316706+4.20×108X(r=0.995),由此得到标准曲线。

在发酵进行到6、12h时吸取发酵豆浆样品100mL,4000r/min离心得到上清,在80℃烘箱中干燥。干燥物用200mL的80%(V/V)乙醇80℃恒温水浴中回流提取2h,回流提取两次。合并提取液,减压蒸干,用无水乙醇定容至10.00mL作为待测液,将待测液测定后对照标准曲线得到含量值。

1.2.7 感官评价 对发酵豆浆的感官性质采用感官定量分析法,以9分评分制进行感官评价。30名经过感官评价的感官评价员分别对水豆豉样品的光泽度、大豆香气、细腻感、粘稠感、豆腥味、香甜味、酸涩味、综合口感和总体评价进行评分[11],然后将测试样品的标号随机改变后重复进行3次评价,得到最终评分。评分标准为∶极不喜欢或极弱(1分),不喜欢或较弱(3分),可接受或中等(5分),喜欢或强烈(7分),极喜欢或极强烈(9分)。

1.3 数据统计

使用SAS统计软件对所得到重复3次实验的数据采用one-way ANOVA法分析各组数据结果之间是否存在统计学差异(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同乳杆菌耐受人工胃液和胆盐的比较

部分乳杆菌能作为益生菌存在于人体肠道里成为正常肠道菌的组成部分,这部分作为益生菌的乳杆菌能在人体胃和小肠前段存活[12],发酵豆浆中的乳杆菌耐受胃液的能力可以作为检测发酵豆浆有益功效的一个指标。由表1可知,通过取样检测后可以看到在pH3.0人工胃液中牦牛酸乳分离乳酸乳杆菌的存活率大大高于商业用保加利亚乳杆菌,可见牦牛酸乳分离乳杆菌的抗胃酸性更强,更有利于起到益生菌的功效。在胆汁中的存活率也是衡量益生菌的一个重要方面[13],胆盐胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐,通过检测耐受胆盐的能力可以判断益生菌适应胆汁的程度。通过取样检测后可以观察到牦牛酸乳分离乳杆菌在1.0%胆盐下的生长率达到商业用保加利亚乳杆菌5倍以上,从中看出牦牛酸乳分离乳杆菌具备很强的耐受胆盐能力,且远高于保加利亚乳杆菌,可以作为益生菌使用。

表1 不同菌种耐胃酸和胆盐的能力Table 1 Ability of resistance to gastric acid and cholate by different kinds of strains

2.2 不同菌种发酵豆浆的pH和总酸度

由表2可知,新鲜未发酵的豆浆加入菌种后的接近中性,经过6h发酵后,pH和总酸度均发生变化,发酵后的三种豆浆的pH都低于未发酵豆浆,呈显著差异(p<0.05)。牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆的pH显著高于混合菌发酵豆浆,保加利亚乳杆发酵豆浆的pH最低(p<0.05)。12h发酵后各菌种发酵后豆浆的pH表现出和6h发酵豆浆同样的趋势,牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆的pH最高,高于混合菌发酵豆浆,商业用保加利亚乳杆发酵豆浆的pH最低,并且各菌种发酵的豆浆的pH明显低于6h发酵豆浆(p<0.05)。pH可以代表所检样品的酸碱环境,由于所有发酵豆浆的pH均低于7,所以发酵豆浆总酸度较未发酵豆浆有所提高。6h和12h发酵后,保加利亚乳杆菌发酵豆浆的总酸比相同发酵时间牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆明显提高(p<0.05),混合菌发酵豆浆的总酸度介于两者之间,12h发酵的各组豆浆的总酸度都明显高于6h发酵的豆浆(p<0.05)。

表2 不同菌种发酵豆浆的pH和总酸度Table 2 The changes of pH and total acidity in different strains fermented soybean milk

2.3 不同菌种发酵豆浆的活菌数

通过观察发酵内活菌数量可以判断豆浆的发酵程度强弱[14]。通过测定可以看到经过6h发酵后牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆内的活菌数高于保加利亚乳杆菌发酵豆浆内活菌数,但是大大小于混合菌种发酵后豆浆内的活菌数(图1)。经过12h发酵后各菌种发酵豆浆内的活菌数都获得增加,但是保加利亚乳杆菌发酵豆浆内的活菌数超过牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆,混合菌发酵豆浆内的活菌数依旧最高。牦牛酸乳分离乳杆菌在最初6h内增长速度高于保加利亚乳杆菌,但是6h后降低,这可能是由于牦牛酸乳分离乳杆菌为适应低温高海拔的环境,可能在长期适应过程中造成的分裂增殖速度减慢造成。混合菌由于多种类细菌间发生协同效应,相互创造有利的生存条件,生长增值过程更快[15],本研究中混合菌发酵时也出现了相似的结果。

图1 不同菌种发酵豆浆的活菌数Fig.1 The viable counts in different strains fermented soybean milk

2.4 不同菌种发酵豆浆的氨基酸态氮含量

发酵产品中一些特定成分的含量对产品的风味有很大的影响,氨基酸态氮的含量可表示大豆产品中鲜味的程度[16]。经过乳杆菌发酵后的豆浆中氨基酸态氮含量较未发酵豆浆有所提高,各组发酵豆浆12h发酵时比6h发酵时氨基酸态氮含量也有所提高(图2)。牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆中的氨基酸态氮含量低于混合菌发酵豆浆,高于保加利亚乳杆菌发酵豆浆(p<0.05)。牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆中pH高于保加利亚乳杆菌发酵豆浆,由于高pH可增加氨基酸转化率,生成更多氨基酸态氮[17],所以牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆中氨基酸态氮含量较高;混合菌发酵豆浆的pH也较高,并且由于混合菌发酵活菌数增加,发酵程度更为强烈,氨基酸态氮含量获得了最大的提高。

图2 不同菌种发酵豆浆的氨基酸态氮含量Fig.2 The content of amino ammonia type nitrogen in different strains fermented soybean milk

2.5 不同菌种发酵豆浆的大豆异黄酮含量

样品处理后,于色谱条件下进样测定,从回归方程中求得样品的浓度并换算出样品中大豆黄素和金雀异黄素的含量。在发酵过程中最初6h内各菌种发酵的豆浆内的大豆黄素含量都急速增加,特别是混合菌发酵豆浆的大豆黄素含量增加得最为明显,牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆中的的大豆黄素也发生明显改变,起含量增加的趋势仅略微低于混合菌发酵豆浆,商业用保加利亚乳杆菌发酵豆浆的大豆黄素含量也出现增加,但较另外两种发酵豆浆有一定差距。6~12h发酵过程中三种发酵豆浆随着发酵的进行,大豆黄素含量任然缓慢增加,但是增加的幅度较初始6h大幅度下降(图3)。同时由图4可以看到,金雀异黄素和大豆黄素一样,在发酵豆浆中的含量随着发酵过程的进行而增加,最初6h内各组豆浆增加的趋势也是大幅度增加,且混合菌发酵豆浆增加的趋势高于牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆,保加利亚乳杆菌发酵豆浆的增加的趋势较另两种豆浆缓慢。6h后三组豆浆金雀异黄素增加的趋势趋于停止。异黄酮具有降低胆固醇,预防心血管疾病和癌症的作用,其中大豆黄素和金雀异黄素属于大豆异黄酮中游离型苷元类型,可以直接被人体吸收利用,是大豆异黄酮中最主要的功能性成分类型[18]。本研究中牦牛酸乳分离乳杆菌和混合菌发酵豆浆具有较高的游离型苷元大豆异黄酮,作为功能性食品其功能性成分含量高于商业保加利亚乳杆菌单一菌种发酵豆浆。单一菌种发酵食品时酶作用简单,多菌种混合发酵时酶系复杂,采用合理的菌种混合比例可以加强菌种间相互作用,产生更多的发酵有益成分[19],本文中也得出了相似的结果。

图3 不同菌种发酵豆浆的大豆黄素含量Fig.3 The content of daidzein in different strains fermented soybean milk

图4 不同菌种发酵豆浆的金雀异黄素含量Fig.4 The content of genistein in different strains fermented soybean milk

2.6 不同菌种发酵豆浆的感官评价

感官评价员对不同菌种发酵豆浆进行感官评价(图5),经过统计后可以观察到在光泽度、大豆香气、细腻感、粘稠感、香甜味、综合口感和总体评价上牦牛酸乳分离乳杆菌和混合菌发酵豆浆较为接近,且明显高于商业保加利亚乳杆菌单一菌种发酵豆浆。保加利亚乳杆菌发酵豆浆的豆腥味和酸涩味较其他两种发酵豆浆更为明显。可见牦牛酸乳分离乳杆菌和加入其的混合菌发酵的豆浆具有更好的感官品质。

图5 不同菌种发酵豆浆的感官评价Fig.5 The sensory evaluation of different strains fermented soybean milk

3 结论

从实验结果可以看出,牦牛酸乳分离乳杆菌的耐受人工胃液和胆盐的能力远强于一般商业保加利亚乳杆菌,分别用这两种菌种单独发酵和混合发酵的豆浆之间的品质也存在差异。牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆的pH和活菌数在6h发酵时均显著高于商业保加利亚乳杆菌发酵豆浆,发酵到和12h时低于保加利亚乳杆菌发酵豆浆,在6h和12h发酵时酸度则明显低于保加利亚乳杆菌发酵豆浆,混合菌发酵的pH和酸度介于两者之间,活菌数最多(p<0.05)。由此看出牦牛酸乳分离乳杆菌具有更强的活性,这些活性影响了豆浆中主要的大豆异黄酮的含量,牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆的活性大豆异黄酮(大豆黄素和金雀异黄素)含量明显高于商业保加利亚乳杆菌发酵豆浆,而混合菌发酵豆浆因为多菌种的联合作用产生了最多的活性大豆异黄酮,成为品质最好的产品。由于理化性质等原因产生的品质差异对口感产生的影响与感官实验结果相对应,理化性质更好的豆浆其口感也更好。综合实验结果可以得出牦牛酸乳分离乳杆菌菌种能力由于商业保加利亚乳杆菌,在其他发酵条件都相同的状况下,牦牛酸乳分离乳杆菌发酵豆浆的理化特性各指标较保加利亚乳杆菌除酸度外均显著升高(p<0.05),采用该菌种生产的发酵豆浆品质突破传统菌种发酵豆浆到达一个新的水平,可以开发利用生产出一种品质优秀的全新产品。混合菌发酵豆浆的品质较单一菌种发酵更优,其联合发酵产生更好品质的机制有待进一步研究。

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Study on Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt fermented soybean milk in physicochemical properties

ZHAO Xin,LI Gui-jie*
(Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

The present study aimed to investigate the physicochemical properties of Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt(LFYY)fermented soybean milk.The artificial gastric juice survival and growth rate in bile salt of LFYY were about four and seven times higher than Lactobacillus bulgaricus(LB).The pH of LFYY fermented soybean milk was higher than mixture bacterial strains(LM,LFYY∶LB=1∶1)fermented one,and LB fermented soybean milk showed the lowest pH after 6 and 12h fermentation.Total acidity of these fermented soybean milk showed the opposite trends with the pH.In the fermentation process at 6h and 12h,the counts of Lactobacillus in LM fermented soybean milk were more than LFYY and LM fermented soybean milk.The amino type nitrogen content and activity of isoflavones(daidzein and genistein)in LFYY fermented soybean milk were close to LB one,and more than LM one(p<0.05).The sensory qualities of LFYY and LM fermented soybean milk were also better than LB one.From there results,LFYY fermented soybean milk showed the better qualities than LB one,the LM could increased the qualities of fermented soybean milk.Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt is good for fermented soybean milk produce.

soybean milk;Lactobacillus fermentum isolated from yak yogurt;amino type nitrogen;isoflavone

TS201.1

A

1002-0306(2014)10-0224-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.042

2013-08-01 *通讯联系人

赵欣(1981-),男,博士,教授,研究方向:食品营养和功能性食品开发。

2013年重庆高校创新团队建设计划资助项目(KJTD201325);重庆市教委科学技术研究项目(KJ131503);重庆第二师范学院教改项目(JG20132206)。

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