乙肝病毒DNA定量水平和乙型肝炎病毒标志物定量检测指标相关性研究

杨 勇，王占科，陈 鑫，钟 莹

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)标志物是HBV颗粒外壳蛋白成分诱导机体产生的抗体，结果异常并不意味着外周血存在HBV完整颗粒［1-4］。通过检测HBV DNA可以了解HBV在体内存在的数量，HBV是否复制，乙型肝炎是否具有传染性及传染性有多强，是否有必要服药，确定肝功能改变是否是由病毒引起，判断适合用哪类抗病毒药物及药物治疗的效果［5-8］。因此，HBV DNA定量检测在临床上意义重大。HBV标志物定性检测与HBV DNA定量检测的相关性研究，国内外已有报道［9-12］，但HBV标志物定量检测与HBV DNA定量检测的相关性研究，国内报道不多，为此，我们以大三阳和小三阳患者作为研究对象，同时检测其HBV标志物定量结果和HBV DNA定量结果，并进行统计学分析和比较，旨在探讨HBV标志物定量检测和HBV DNA定量检测在判断HBV感染者传染性中的临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2013年1月1日—2014年6月1日来我院检验科采用酶联免疫吸附试验(ELISA)确诊的在感染性疾病科门诊就诊和住院的大三阳368例和小三阳507例中，各随机选取50例作为大三阳组和小三阳组。大三阳组外周血HBV标志物HBsAg阳性、HBeAg阳性和HBcAb阳性，小三阳组组外周血HBsAg阳性、HBeAb阳性和HBcAb阳性。大三阳组男女性别比为 1:0．45，年龄(40．32±12.36)岁;小三阳组男女性别比为1:0．51，年龄(42．80±12．36)岁，大三阳组和小三阳组性别构成比、年龄之间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料与方法 大三阳组和小三阳组的血标本同时做HBV标志物定量和HBV DNA定量检测。外周血HBV标志物定量检测采用时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)测定，ELISA定性检测HBV标志物试剂盒从北京万泰生物技术有限公司购买，在上海普朗酶标仪上进行测定，实验操作和结果判读参考试剂盒操作说明书进行，阳性对照检测结果阳性，阴性对照检测结果阴性，室内质量控制在控。外周血HBV DNA定量检测采用实时荧光定量PCR技术进行测定，试剂盒及实时荧光定量PCR扩增仪从厦门安普利生物技术有限公司购买，并保证室内质量控制结果在控，我院检验科基因扩增PCR实验室通过省卫生厅验收合格。

1.3 结果判读标准 HBV标志物定量检测结果≥正常参考范围上限为阳性，用实际数值表示;HBsAg结果超过240 ng/ml，需对检测标本进行倍比稀释后进行检测，结果乘以稀释倍数，检测结果低于正常参考范围下限为阴性。HBV DNA定量检测结果用每毫升样本的DNA拷贝数(copies/ml)表示，≤500为阴性。实时荧光定量PCR以起始HBV DNA标准品拷贝数的对数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标，建立标准工作曲线，根据待测样品的Ct值计算待测样品的HBV DNA的拷贝数。

1.4 统计学分析 检测到的阴性或阳性结果用百分率表示，采用卡方检验。检测到的计量数据，先通过正态分布性检验，如果数据呈正态分布用均数±标准差(±s)表示，如果数据不呈正态分布需进行对数转换后呈正态分布，再用均数±标准差(±s)表示，HBV DNA定量检测结果数据需要进行对数转换，采用t检验。相关性分析应用相关系数显著性分析。α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 大三阳组和小三阳组HBV标志物定量和HBV DNA定量检测结果分析 大三阳组定量检测HBsAb和 HBeAb均为阴性;小三阳组定量检测HbeAg均为阴性;大三阳组 HBsAg含量和 HBV DNA定量检测结果均明显高于小三阳组(P＜0.01)，HBcAb与小三阳组比较，无显著性差异(P＞0．05)，见表1。

表1 2组乙型肝炎患者乙型肝炎病毒标志物和乙肝病毒DNA定量检测结果比较(±s)

表1 2组乙型肝炎患者乙型肝炎病毒标志物和乙肝病毒DNA定量检测结果比较(±s)

注:b P＜0.01

项目 单位 大三阳组(n=50)小三阳组(n=50)HBsAg ng/ml 165．23 ±86．14 42．18 ±16．77b HBsAb mIU/ml 阴性(＜10．0) 阴性(＜10．0)HBeAg PEIU/ml 26．56 ±12．14 阴性(＜0．5)HBeAb PEIU/ml 阴性(＜0．2) 3．02 ±0．81 HBcAb PEIU/ml 3．36 ±0．60 3．17 ±0．82 HBV DNA Lg(copies/ml) 7．32 ±1．30 4．35 ±2．11b

2.2 大三阳组和小三阳组HBV DNA定量阳性率比较 大三阳组HBV DNA定量阳性率为96．00%(48/50)，小三阳组阳性率为 16．00%(8/50)，二者差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 HBV DNA阳性的大三阳患者HBV DNA含量与HBeAg含量相关性研究 48例HBV DNA阳性的大三阳患者HBV DNA含量与HBsAg相关系数为0．6832，与 HBeAg 含量相关系数为 0．8563，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大，传播途径不确定［13-16］。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3．5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌［17-20］。HBV感染者部分发展成肝炎，部分为正常携带者，也有部分发展成肝硬化和肝癌［21-23］。HBV感染率高，不仅危害社会公共健康，也是医务人员职业暴露时容易感染的病毒［24-25］，HBV感染者一部分人群为正常人群，无传染性，也有部分人群具有传染性，判断HBV感染者是否具有传染性，对做好HBV感染控制和预防工作，具有重要意义［26-29］。

HBV是一种具有嗜肝细胞生物学特征的双链DNA病毒，为部分双链环状DNA。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即前S/S区、前C/C区、P区和X区。前S/S区编码大(前S1、前S2及S)、中(前S2及S)、小(S)3种包膜蛋白;前C/C区编码HBeAg及HBcAg;P区编码聚合酶;X区编码X蛋白。HBV基因组长度为3．2 kb，病毒完整颗粒为42 nm，包括病毒颗粒外壳和内核两部分，1965年由Dane发现，又称丹妮颗粒［30］。HBV主要存在于患者肝细胞内，如果HBV不复制或不活动，完整的病毒颗粒一般不会通过肝细胞膜释放或分泌到肝细胞外，只分泌一些HBV外壳中的部分抗原物质，如HBV表面抗原等。肝脏是一个血供极其丰富的器官，一旦HBV从肝细胞内溢出，完整的含有病毒DNA的 HBV颗粒就存在于血液中［31］。外周血HBV存在3种形式，一是直径为22 nm的球形颗粒，无传染性，一般为 HBsAg蛋白;二是直径为22 nm，长度为100 nm以上的管状颗粒，也主要由HBsAg组成，不含核酸，无传染性;三是大球形颗粒，也就是完整的HBV颗粒，直径约42 nm，分为包膜和核心两部分。包膜含HBsAg、HbeAg等抗原，核心含HBcAg抗原、环状双股HBV DNA和HBV DNA多聚酶，具有传染性。因此，判断HBV感染者是否具有传染性主要取决于外周血有没有完整的HBVDNA 和 HBeAg。

检测HBV标志物的方法有很多，ELISA是检测HBV标志物的经典方法，但只能定性，定量比较困难，不能确定患者血液中HBV相关抗原和抗体的含量，这对观察HBsAg的含量变化、判断临床治疗效果造成困难。TRFIA是一种继放射免疫、酶免疫和发光免疫后的一种非放射性标记免疫分析技术。镧系元素的螯合物为TRFIA所使用标记物，具有发出的荧光时间长、强度高等特点，因为大部分背景非特异荧光都是短暂存在的短时间荧光，镧系金属螯合物发出的荧光时间长，可有效地避免本底非特异荧光的干扰，故称TRFIA［32］。TRFIA是一种定量检测HBV标志物的新方法，具有灵敏度高、特异性好等特点［33］。本实验表明:ELISA证实的大三阳和小三阳患者经TRFIA方法检测均证实为大三阳和小三阳患者，提示HBV定量检测和定性检测结果一致。定性检测向定量检测发展是检验技术创新的方向，实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术为准确定量检测外周血中HBV颗粒DNA水平，提供实验工具［34］。

本研究结果表明:大三阳患者HBV表面抗原含量明显高于小三阳患者，提示大三阳患者体内病毒含量较多，进一步研究证明，大三阳患者HBV DNA含量也明显高于小三阳患者，为判断大三阳患者具有较强的传染性提供直接实验室证据。同时，研究结果也表明:大三阳患者HBV DNA阳性率明显高于小三阳患者，但并不是所有的小三阳患者HBV DNA都是阴性，也不是全部大三阳患者HBV DNA都是阳性，提示并不是全部小三阳患者都没有传染性，也不是全部大三阳患者都具有传染性。判断HBV感染者是否具备传染性，必须结合PCR的方法检测HBV DNA。当外周血存在完整的包裹DNA的病毒颗粒时，PCR才能检测出阳性结果。HBV完整颗粒从肝细胞内分泌到外周血，是HBV正在复制的标记，HBV在复制过程中，高表达HBeAg到血液中，这可能是我们发现的HBV DNA含量和HBeAg明显正相关，且相关系数大于其和HBsAg相关系数的原因。

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