减毒沙门菌载体在肿瘤基因治疗中的研究进展

贾庆华，惠 玲

目前基因治疗发展迅速，肿瘤基因治疗方法已经逐步从实验及基础研究过渡到临床试用阶段，理论和技术层次上日趋成熟。然而基因治疗还没达到完全安全、高效、准确的目标，其中基因治疗的载体是最受关注问题之一。合适的载体应具备最大的有效性和最小的毒性，传统生物类载体主要是病毒载体和非病毒载体。目前低毒或无毒的且具有靶向性感染特点的细菌载体在肿瘤基因治疗得到证实，充分说明了细菌载体开辟抗肿瘤治疗的新途径。本文就减毒沙门菌作为载体在肿瘤基因治疗中的应用综述如下。

1 减毒沙门菌的抗肿瘤研究

大量研究表明沙门菌本身不仅对肿瘤有直接的溶瘤作用，而且减毒株较野生株具有更好的靶向定植性［1-2］。因而利用基因工程技术将沙门菌染色体基因组改造以实现毒力减弱而得到减毒菌株，如随机插入1个转座子或删除1段或几段致病基因，在降低对宿主致病力的同时，仍可保留其高度的免疫原性，从而为临床应用提供了安全性的前提［3-4］。利用减毒沙门菌选择性地在肿瘤组织内复制、增生来抑制多种肿瘤细胞的生长，从而延长宿主存活时间，并能改变宿主免疫应答［5-6］。

Zheng等［7］应用沙门伤寒杆菌减毒株VNP20009(pur-、msd-、xyl-)做了临床前实验，通过静脉给小鼠一次注射多种荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人结肠癌、肺癌、乳腺癌、肺肉瘤等)，发现相对于正常部位，细菌聚集在肿瘤部位(包括转移瘤)大约为200～1000倍，肿瘤组织生长得到控制，即使在小细胞肺癌转移模型上，肿瘤生长亦延缓，动物的生存时间得以延长。由此推测沙门菌导致肿瘤生长减慢可能因为肿瘤生长所需要的营养物质为细菌所消耗［8-9］。细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸，细菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)，都可影响肿瘤血管形成，此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可激活潜在抗肿瘤T细胞［10］。

Niethammer等［11］发现以减毒沙门菌SL7207为载体，将flk-1全长cDNA构建到真核表达质粒，制成口服疫苗后免疫小鼠Lewis肺腺癌等肿瘤模型，这种口服疫苗能打破免疫耐受，诱导很强的特异性CTL反应，从而摧毁肿瘤血管内皮细胞，既可对小鼠起到免疫保护作用，同时对移植瘤也具有治疗效果，能抑制肿瘤生长和转移。冯珂珂等［12］将携带flk1的重组减毒沙门菌经口服免疫，诱导小鼠产生抗flk1的特异性免疫反应，且能明显产生抗肿瘤血管生成作用。

邵月婷等［13］建立裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，分别将已构建的重组表达质粒siRNA-scramble、p53、siRNA-survivin及共表达质粒 p53/siRNA-survivin转化到减毒人伤寒沙门菌Ty21a，制备成对应重组减毒沙门菌，通过灌胃及瘤内注射到前列腺癌荷瘤裸鼠体内，观察到肿瘤体积明显缩小，对前列腺癌移植瘤有明显的靶向性。陈英利等［14］将携带Survivin-△3(T34A)基因的减毒鼠伤寒沙门菌口服疫苗用于乳腺瘤MCF-7注射细胞小鼠并观察其保护作用，发现小鼠口服携带Survivin-△3(T34A)真核质粒的沙门菌后，能够抑制MCF-7乳腺瘤细胞的增殖和扩散，而且能够对小鼠起到保护的作用。

Hong等［15］发现注射减毒沙门菌疫苗提供了新型的抗癌治疗途径，该疫苗诱导具有免疫抑制的骨髓细胞转化成TNF-α分泌的中性粒细胞，并减少Treg细胞的产生，特别是在肿瘤特异性细胞毒素T淋巴细胞的表达中，同时也说明该疫苗诱导了肿瘤微环境从免疫抑制到免疫原性的改变，减少抑制的阻力，最终产生成功的抗肿瘤应答。

2 减毒沙门菌作为肿瘤基因治疗载体的研究进展

2.1 减毒沙门菌具有抗肿瘤理想基因传递载体的特征 减毒的沙门菌仍保持侵入巨噬细胞、树突细胞的能力，因此可作为疫苗载体将其携带的抗原蛋白或DNA疫苗靶向性的传递给抗原递呈细胞从而更为有效地激发免疫应答。减毒沙门菌作为疫苗载体不仅具有运送效率高，而且免疫方法简单和效果好，并能同时激发全身免疫和局部黏膜免疫等优点，有着良好的应用前景。目前重组减毒沙门菌携带的DNA疫苗激发机体的细胞免疫和体液免疫的机制可能是树突状细胞(DC)吞噬侵入肠黏膜屏障的重组沙门菌后被激活，活化的DC迁移至脾脏等淋巴组织，此时载体菌裂解，DNA疫苗以某种途径进入胞液，然后进入抗原递呈细胞(APC)细胞核，表达目的抗原。进而特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)被激活，裂解表达抗原的APC，APC内的抗原被释放激活辅助T细胞和诱导抗体反应，至此细胞免疫和体液免疫均被激活［16］。此外，载体菌的成分如脂多糖和DNA疫苗上的单链免疫刺激序列还可作为佐剂加强免疫应答。另一种可能的机制是重组沙门菌引起吞噬它的APC的凋亡，凋亡产物(可含目的抗原/DNA免疫缺陷)被邻近的APC吞噬，进而激活特异的 CTL［17］。

以减毒沙门菌作为外源DNA的载体，采用重组减毒胞内菌运送DNA疫苗可以将DNA疫苗直接呈送给APCs，因减毒沙门菌侵入淋巴系统，能更有效地激发宿主的细胞免疫应答，并同时激活体液免疫，并可获得对载体菌的免疫等优点。用减毒沙门菌作为疫苗载体其他优点包括［18-19］:①减毒沙门菌可携带原核表达质粒也可以携带真核表达质粒;②细菌易于扩增，抗原不需纯化，也不需要纯化DNA，节省费用;③重组减毒菌疫苗可经口服、鼻内、直肠免疫等多种途径，方便高效;④免疫具有持续性，减毒沙门菌为载体表达的外源蛋白对宿主具有持续刺激的作用，不需要反复加强免疫。

2.2 携带细胞因子治疗肿瘤的研究 细胞因子是一类由活化的免疫细胞(单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)或间质细胞(血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞等)所合成、分泌，具有调节细胞生长、分化成熟、调节免疫应答、参与炎症反应、促进创伤愈合和参与肿瘤消长等功能的小分子多肽类活性分子。目前已有多种细胞因子应用于抗肿瘤治疗研究，经大量动物实验证实，IFN、IL-2、TNF、GM-CSF和G-CSF等细胞因子都能增强机体对肿瘤的免疫能力。

江中明等［20］等将携带HIV tip30与人IFN-γ基因减毒沙门菌(SL7207)基因口服治疗舌癌荷瘤裸鼠，发现口服重组减毒沙门菌具有体内瘤体转基因的能力，而且可使同时携带的HIV tip30与人IFN-γ 2个目的基因同时达到瘤体细胞内表达，发挥协同抗瘤作用，为舌癌的基因治疗提供了新的方法。

齐桓等［21］通过电转化法将真核表达载体pCMVhIL-12、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261中，经由胃管喂给BALB/c和C57BL/6小鼠。小鼠血清中mIL-12含量在相应的处理组中均有显著升高，进一步说明减毒沙门菌可将外源基因携带入小鼠组织细胞内，并进行有效表达。Jarosz等［22］构建携带IL-12基因的DNA疫苗口服于接种前后有免疫活性的小鼠，激活的细胞毒性的T淋巴细胞特异性的抑制上皮细胞和肿瘤细胞过表达的Endoglin。疫苗减少肿瘤中微血管密度并降低Treg淋巴细胞水平，因而有效地抑制肿瘤生长和延长了具有肿瘤细胞小鼠的存活。Ha等［23］将构建成功的携带IL-2的减毒沙门菌转染肝癌细胞，并予具有肝癌组织的小鼠口服，结果发现该减毒沙门菌有效地转染癌细胞，IL-2也有效地表达，与此同时延长了小鼠的存活时间。

Bai等［24］构建携带生长抑素激素的口服减毒沙门菌疫苗(pGM-CSF/SS)，免疫于 5、7、11周雌鼠，发现GM-CSF和减毒沙门菌分别作为佐剂和减毒活性载体，通过与生长抑素DNA疫苗结合有效地口服传递并诱导体液免疫应答和提高雌鼠的重量。此外，该DNA疫苗影响雌激素浓度和求偶期，以及提高雌鼠哺乳期行为。

血管内皮生长因子(VEGF)是目前所知的促肿瘤血管生成活性最强、特性最高的血管生长因子，与其功能受体VEGF-2构成VEGF/VEGFF-2信号传导通路，如果阻断该信号通路，可以抑制肿瘤生长和转移。VEGFR-2在鼠中为 flk-1，陈明清等［25］构建减毒沙门菌SL3261为载体的抗肿瘤血管生成口服DNA疫苗pcDNA3．1+/flk-1(nl-7)，发现该疫苗具有抑制小鼠结肠癌肝转移的作用。

2.3 携带效应蛋白治疗肿瘤的研究 减毒沙门菌可以有效地传递多种效应基因并表达治疗性蛋白。Fu等［26］构建重组减毒沙门菌作为真核表达载体携带Smac和TRAIL基因(pSNhTS)，并受控于hTERT启动子，结果发现沙门菌介导的外源基因表达在肿瘤组织中可以持续14 d，小鼠口服pSNhTS后明显抑制肿瘤增长的70%～90%并延长小鼠存活时间。pSNhTS所具有的超强抗肿瘤活性主要原因是Smac和TRAIL重组蛋白的相互协作特性。Jiang等［27］构建表达治疗基因ClyA和Rluc8的减毒沙门菌静脉注射于肿瘤小鼠，该菌定位于肿瘤组织，基因表达主要依赖启动子的浓度，说明体外控制细菌基因表达的可能性，而且明显地抑制原位癌和转移癌的生长并延长小鼠寿命。

林勇等［28］成功构建含有 pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株，检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中正确表达，表明减毒鼠伤寒沙门菌具有呈递该基因至胰腺癌细胞中的能力。王川等［29］将真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9及干扰质粒pshRNA-AQP9成功地电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207，为进一步研究 AQP对非酒精性脂肪肝(NFLD)的基因治疗奠定基础。

曾曙光等［30］研究携带结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)、人单纯疱疹病毒－胸苷激酶(HSV-TK)双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应，发现减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有显著抑制作用。陈丽华等［31］发现survivin特异性siRNA体外可明显抑制肝癌HepG2细胞增殖，并促进其凋亡，将携带survivin siRNA质粒减毒沙门菌腹腔注射后可明显抑制肝癌皮下移植瘤的生长，其机制可能与细胞凋亡有关。

Guan等［32］将携带凋亡素(Apoptin)表达质粒的减毒沙门菌转染于喉癌细胞，该菌减少了细胞毒性，通过激活Caspase-3明显促进细胞凋亡，重组菌系统地注射引起肿瘤生长延迟和减少肿瘤微血管密度，因而延长宿主存活，此研究说明重组减毒沙门菌作为Apoptin表达载体有潜在的抗癌治疗作用。

3 展望

减毒沙门菌是一种良好的基因传递载体，动物实验及临床初期实验中证实了该菌具有一定抗肿瘤作用，然而肿瘤基因治疗目前还处于发展阶段，动物实验的结果尚不能在临床中得到广泛应用。因为其仍然存在一些问题，如沙门菌内毒素的致病作用，在血中大量繁殖引发菌血症的危险，沙门菌对乏氧组织的靶向定植特异性还不足，以及外源基因插入是否会导致毒力返强、外源基因表达量是否稳定、诱导的体液免疫反应不足。此外如何提高沙门菌载体转移到人体肿瘤细胞和组织内部，如何有效地减轻人体对重组载体的免疫作用及将基因治疗与其他治疗方法联合应用等，都是肿瘤基因治疗中需要攻克的难题。

这些关键问题是今后研究主要方向，如何通过提高治疗基因的表达效率，筛选出靶向性更强、安全性更高的减毒沙门菌菌株是减毒沙门菌抗肿瘤治疗研究的重中之重。减毒沙门菌载体在肿瘤基因治疗上的应用目前拥有广阔发展前景，其具有运送效率高，免疫方法简单，效果好等特点，必定在肿瘤治疗中发挥举足轻重的作用。

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