肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变检测的临床意义

孟加榕，潘羡心，郭以河，温路生，刘美莲，禹 乐，戴太监

分子靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)在肺腺癌患者的治疗中已得到广泛的认可和应用［1-7］。研究证实EGFR-TKI与表皮生长因子受体(EGFR)的激活突变有关。因此患者在使用TKI药物前需进行EGFR基因突变检测［1，2，8-10］。许多晚期肺腺癌患者因为失去了手术机会而难以获得组织标本，而胸腔积液是晚期该类患者常见的并发症之一，且此标本较容易获取。已有研究证实高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是较准确、敏感、快速且可用于临床的基因突变检测方法［11-13］。笔者前期已应用HRM方法对肺腺癌患者胸腔积液上清液、细胞块EGFR基因突变的临床意义进行了探讨［14-15］。关于肺腺癌胸腔积液细胞块及上清液成分进行EGFR基因突变检测的比较尚未见报道。本文旨在应用HRM方法比较这两种恶性胸腔积液成分EGFR基因突变状态，为寻找有效的胸腔积液成分进行高效快速EGFR基因突变检测提供实验依据，更好地为临床服务。

1 材料与方法

1.1 材料 收集解放军175医院2010年9月—2013年5月临床送检胸腔积液标本43例，细胞学涂片中均检到癌细胞，胸腔积液细胞块经HE染色和免疫组化确诊为肺腺癌，限定癌细胞量占细胞总量5%以上的样本为合格样本，用于后续实验。43例中男21例，女22例;不吸烟患者32例，曾经吸烟和目前仍吸烟患者11例;临床分期均为Ⅲ～Ⅳ期，均未接受过TKI类药物治疗。

1.2 试剂胸腔积液上清液DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，美国QIAGEN公司);石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue kit，美国QIAGEN公司);EGFR基因突变检测试剂盒(广州好芝生物科技有限公司)。

1.3 仪器 Light Cycle 480II实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司);荧光凝胶成像分析系统(美国UVP公司);Amoydx-Giraffe紫外分光光度计SMA4000(厦门艾德生物医药科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 胸腔积液上清液制备方法:临床送检的新鲜胸腔积液标本，取约12 ml置入15 ml离心管中，2000 r/min，离心5 min，收集上清液。

1.4.2 胸腔积液细胞块制备方法:①临床送检新鲜胸腔积液，用15 ml尖底离心管取约12 ml胸腔积液，2000 r/min，离心5 min，弃上清，如细胞量过少，可重复离心，弃上清;②加入4%中性甲醛6 ml，震荡混匀;③静置 30 min左右，2000 r/min，离心5 min，弃上清;④用吸管将离心管底部的沉淀吸取至显微镜擦镜纸上，包好，置入4%中性甲醛中固定，后经组织脱水浸蜡，制成石蜡细胞块。

1.4.3 DNA提取和定量分析:选择经HE染色和免疫组化确诊为肺腺癌且癌细胞量占细胞总量5%以上的病例，试剂盒法分别提取其上清液和细胞块DNA。将提取好的DNA样本通过紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，将DNA浓度稀释至4 ng/μl，浓度低于4 ng/μl的样品直接取原液进行实验。

1.4.4 引物设计:采用引物设计软件(primer premier 5．0)设计外显子 18-21引物，并使用 Primer-BLAST软件分析其特异性，确定熔解温度。如表1所示，所有扩增片段均＜250 bp，符合HRM小片段的要求。

表1 HRM-PCR引物序列

1.4.5 HRM法分析:应用基于HRM-PCR技术的EGFR基因突变检测试剂盒，对胸腔积液上清液DNA和细胞块 DNA EGFR 基因第18、19、20、21外显子分别进行突变检测。HRM-PCR反应体系为10 μl，样本 DNA(浓度 4 ng/μl)取 5 μl，检测反应液 3．9 μl，荧光染料 1 μl，DNA 聚合酶 0．1 μl，每个外显子分别设野生对照和突变对照。配置好后，在LC480上按照如下反应条件进行HRM检测及结果分析。第一阶段(酶激活阶段):95℃、5 min;第二阶段(PCR 扩增阶段):95℃、30 s，65℃、30 s(检测荧光)，50个循环;第三阶段(熔解阶段):95℃、30 s，40℃、30 s，70 ～ 90℃ (0．03℃ /s、连续荧光采集);第四阶段(冷却阶段):4℃。

1.5 统计学方法 采用SPSS 15．0分析软件进行数据分析，应用χ2检验比较HRM方法检测胸腔积液上清液和细胞块EGFR第18、19、20、21外显子突变率差异，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变率比较 HRM方法检测上清液EGFR基因总突变率为39．53%(17/43)，细胞块EGFR基因总突变率为34．88%(15/43)。两种胸腔积液成分HRM方法检测突变率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变位点分布 胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变位点分布一致，均为第19、21外显子突变，如图1。上清液EGFR基因第19外显子突变14例，第21外显子突变3例;细胞块EGFR基因第19外显子突变12例，第21外显子突变3例。胸腔积液细胞块EGFR第21外显子基因突变与上清液完全一致，为3例相同患者，如图2A。胸腔积液上清液EGFR第19外显子基因突变阳性而细胞块阴性的病例3例，如图2B。上清液EGFR第19外显子突变阴性细胞块检测阳性的病例1例，如图2C。

图1 肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块表皮生长因子受体基因突变高分辨率熔解曲线图

图2 3例肺腺癌胸腔积液细胞块(HE×200)

3 讨论

笔者前期对收集的43例肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块分别进行了EGFR基因突变检测，结果表明HRM方法和基因测序法检测突变率差异均无统计学意义，HRM方法检测灵敏度优于测序［14-15］。灵敏的基因检测方法可以提高胸腔积液EGFR基因突变检出率，可使更多的患者受益于EGFR-TKI药物的治疗。本文主要探讨应用HRM方法检测同一肺腺癌患者胸腔积液上清液和细胞块EGFR基因突变状态，为寻找有效的胸腔积液成分进行高效快速EGFR基因突变检测提供实验依据。

应用HRM法检测肺腺癌患者胸腔积液上清液和细胞块标本，两者突变率差异无统计学意义。EGFR基因突变类型一致，均为第19、21外显子突变。胸腔积液细胞块EGFR第21外显子基因突变的结果与上清液完全一致，为相同患者。胸腔积液上清液EGFR第19外显子基因突变检测阳性而细胞块检测阴性的病例有3例，分析发现该3例患者均为女性，已属肺腺癌Ⅳ期，胸腔积液中炎性细胞、间皮细胞、红细胞所占比例较大(最低达到80%)。上清液存在变性肿瘤细胞核碎片和DNA片段，成分较单一，干扰因素较少，且易于操作，重复性较好，胸腔积液离心后炎性细胞和间皮细胞处于中间层，红细胞处于最底层，两者对上清液结果影响不大，但经甲醛固定、石蜡包埋后，过多的野生型DNA对细胞块结果可能造成干扰，从而造成细胞块EGFR结果假阴性。但上清液癌细胞数量不固定，有时癌细胞DNA含量较少，也易造成假阴性，这种情况下宜选取细胞块进行检测。而上清液EGFR第19外显子突变检测阴性而细胞块检测阳性的病例有1例，为男性患者，实验过程中发现该患者送检胸腔积液肿瘤细胞含量很少，离心多次才富集而得细胞块。上清液可能由于肿瘤DNA片段含量过少导致假阴性。

但胸腔积液细胞块成分大部分为炎细胞、间皮细胞和红细胞，干扰因素多，这些细胞所占比例较大的情况下检测结果可能存在假阴性，故应考虑上清液进行EGFR基因突变检测，简单快速。考虑存在假阴性的可能和肿瘤异质性［16-20］，建议EGFR检测前兼顾细胞学及HE结果，对肿瘤细胞含量和炎性细胞、间皮细胞、红细胞等比例进行评估，炎性细胞、间皮细胞、红细胞等所占比例较大，肿瘤细胞含量较多的情况下宜选取上清液进行检测，肿瘤细胞含量较少，炎性细胞、间皮细胞、红细胞等所占比例较少时宜富集细胞块进行突变检测，临界条件两种成分兼顾，以保证结果的可靠性。因本研究用于两种成分比较的样品数仍较少，故后期将增加样品数以获得临界条件的准确值。

综上所述，肺腺癌胸腔积液上清液和细胞块可用于检测其EGFR基因突变状态，但由于存在假阴性可能以及肿瘤异质性，建议EGFR检测前兼顾细胞学及HE结果，对肿瘤细胞含量和炎性细胞、间皮细胞、红细胞等比例评估，以保证结果的可靠性。

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