葡萄籽原花青素对缺血再灌注肝脏氧化损伤和细胞凋亡的影响

刘仁贵，张自华，秦 燕，苏 娟，杨继武

（1.大理学院附属医院，云南大理 671000；2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

葡萄籽原花青素对缺血再灌注肝脏氧化损伤和细胞凋亡的影响

刘仁贵1，张自华1，秦 燕2，苏 娟2，杨继武1

（1.大理学院附属医院，云南大理 671000；2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的：探讨葡萄籽原花青素对大鼠肝缺血再灌注损伤的抗氧化作用、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法：SD雄性大鼠30只，复制肝缺血再灌注损伤模型。随机分为：假手术组；HIRI模型组；葡萄籽原花青素预处理（GSPE）组（160 mg∕kg），每组10只。于再灌注后3 h检测肝组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量及血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量；光镜下比较各组肝组织形态学的变化；免疫组化法检测GSPE对凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax表达的影响。结果：与HIRI模型组比较，GSPE预处理组血清ALT、AST水平明显降低（P＜0.05）；肝组织GSH-Px、SOD的活性明显升高（P＜0.05），而MDA含量下降（P＜0.05）。光镜下GSPE预处理组肝细胞损伤程度较模型组明显减轻；免疫组化结果显示，GSPE预处理组肝组织Bcl-2蛋白的表达量较模型组明显增多，而Bax蛋白的表达量则较模型组明显减少。结论：GSPE对缺血再灌注肝脏具有一定的抗氧化损伤和抗凋亡的作用。

葡萄籽原花青素；缺血再灌注；肝脏；氧化损伤；Bcl-2，Bax蛋白

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfu⁃sion injury，HIRI）指各种原因导致肝血流中断或不足使肝脏缺血，当恢复血供再灌注后，肝细胞功能代谢障碍及结构破坏反而加重。HIRI在肝移植、休克复苏、严重肝外伤及肝叶切除等过程中均不可避免，是影响上述疾病治疗效果和预后的重要原因之一。因此，如何减轻缺血再灌注肝的损伤是目前肝脏外科特别是肝移植外科的研究热点。但HIRI的机制至今尚未完全阐明，与氧源性自由基的产生、肝细胞凋亡、中性粒细胞的聚集、炎性因子释放等因素都有密切关系。其中氧自由基生成增多及机体抗氧化能力减弱所引发的氧化应激反应是肝细胞缺血再灌注损伤发生的重要原因〔1-2〕。

葡萄籽原花青素（grape seed pro-anthocyanidin extract，GSPE）是从葡萄籽中提取出来的一类多酚化合物，研究表明GSPE是一种很好的自由基清除剂、脂质过氧化抑制剂及抗氧化剂〔3-5〕。体外实验显示，GSPE还具有较强的抗细胞凋亡的作用〔6〕。故本研究通过建立大鼠缺血再灌注肝损伤模型，探讨GSPE对缺血再灌注肝脏氧化损伤和抗凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1试剂谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考马斯亮兰检测试剂盒，以上试剂均购自南京建成生物工程研究所；Bcl-2，Bax抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；GSPE，购自西安小草植物科技有限责任公司，其它试剂均为常用化学试剂。各指标均严格按照试剂盒说明由专人进行统一检测。

1.2主要实验仪器JY88-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；18R冷冻高速离心机TGL-18R（珠海黑马医学仪器有限公司）；电子分析天平CVA214C（奥豪斯仪器上海有限公司）；电子制冰机Barline BF320（斯科茨曼制冰系统上海有限公司）。

1.3实验动物分组及给药SD雄性大鼠30只，体重210～250 g，由昆明医科大学动物实验中心提供，合格证号为SCXK（滇）2011-0004。适应性饲养5 d后，随机分为3组，每组10只：假手术组、肝缺血再灌注损伤模型组及GSPE预处理组。GSPE预处理组于术前3周连续给予2%GSPE水溶液（160 mg∕kg）3 mL灌胃，每天1次，而假手术组和模型组给予同体积的生理盐水灌胃。

1.4动物模型的制备实验前12 h禁食，自由饮水，10%水合氯醛麻醉大鼠（4 mL∕kg）腹腔注射，麻醉显效后腹部消毒，腹部正中切口打开腹腔，暴露肝门，分离出门静脉及肝动脉，用动脉夹夹闭肝左、中叶的入肝血管，阻断入肝血流，制作70%的肝缺血模型，缺血45 min后再灌注3 h，制备大鼠HIRI模型〔1〕，缺血及再灌注期间均暂时关闭腹腔。假手术组暴露肝门后，仅分离出门脉及肝动脉，不夹闭。于再灌注3 h后自下腔静脉取血及取肝脏组织。

1.5指标检测

1.5.1 血清ALT、AST含量的测定 再灌注3 h后自下腔静脉取血3 mL，3 500 r∕min，离心10 min，保留血清备用。血清ALT、AST含量由全自动生化分析仪检测。

1.5.2 肝组织GSH-Px，SOD，MDA含量的检测 切取同一部分肝组织用滤纸擦干，称重0.5 g，置于1∶9冰生理盐水中，用匀浆器充分碾碎肝组织制成10%匀浆，4℃离心（6 500 r∕min，15 min），保留上清液。分别在412 nm、630 nm及532 nm波长处测定肝匀浆中GSH-Px、SOD、MDA的含量。

1.5.3 肝组织HE染色 取另一部分肝组织置于4%多聚甲醛中，固定后制成石蜡切片，HE染色后置于光镜下观察形态学变化。

1.5.4 肝组织Bcl-2，Bax蛋白检测 用免疫组化SP法，按试剂盒说明书操作，200倍光镜，胞浆棕黄色为阳性细胞。

1.6统计学处理数据输入SPSS11.5统计软件处理，结果用平均值±标准差表示，组间比较应用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSPE对肝缺血再灌注大鼠血清ALT、AST含量的影响与假手术组比较，I∕R组、GSPE预处理组大鼠血清ALT及AST水平明显升高（P＜0.05）；与I∕R组比较，GSPE预处理组大鼠血清ALT及AST水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1各组大鼠血清ALT、AST含量的变化（，n=10）

表1各组大鼠血清ALT、AST含量的变化（，n=10）

注：与假手术组相比▲P＜0.05，与I∕R组比较●P＜0.05。

组别假手术组I∕R组GSEP预处理组AST∕（U∕L）52.67±18.56 167.00±13.52▲79.38±15.20▲●ALT∕（U∕L）40.29±9.84 198.03±29.41▲93.46±19.43▲●

2.2 GSPE对肝缺血再灌注大鼠GSH-Px，SOD，MDA含量的影响与假手术组比较，IR组、GSPE预处理大鼠肝组织GSH-Px、SOD活性明显降低（P＜0.05），而MDA的含量升高；与I∕R组比较，GSPE预处理组大鼠肝组织GSH-Px、SOD活性明显升高，同时MDA的含量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝组织GSH-Px、SOD及MDA含量的变化（，n=10）

表2 各组大鼠肝组织GSH-Px、SOD及MDA含量的变化（，n=10）

注：与假手术组相比▲P＜0.05，与I∕R组比较●P＜0.05。

组别假手术组I∕R组GSEP预处理组MDA∕(nmol∕mg) 3.78±0.69 10.12±1.96▲8.03±1.11▲●GSH-Px∕（μmol∕L）296.12±26.10 123.81±15.46▲198.12±16.31▲●SOD∕(U∕mgprot) 223.00±16.58 97.45±11.56▲147.80±13.01▲●

2.3光镜下观察肝组织病理学变化假手术组偶见少部分肝细胞体积增大；HIRI模型组肝细胞体积普遍明显增大，胞浆疏松淡染，部分可见空泡变性及溶解坏死，血窦变窄、扭曲，充血；GSPE预处理组：经GSPE预处理后，与HIRI模型组比较，仅见少部分肝细胞轻度增大。见图1。

图1 各组大鼠肝组织形态学的变化（HE，×400）

2.4肝组织Bcl-2，Bax蛋白表达的变化HIRI模型组Bax蛋白的表达量明显增强，GSPE预处理组Bax蛋白的表达仅分布于坏死灶周围及汇管区；HIRI模型组Bcl-2蛋白的表达量明显减少，而GSPE预处理组后，Bcl-2蛋白的表达量明显增强。见图2-3。

图2 各组大鼠肝组织Bax蛋白免疫组化染色结果（DAB，×200）

图3 各组大鼠肝组织Bcl-2蛋白免疫组化染色结果（DAB，×200）

3 讨论

HIRI在肝移植、休克复苏、严重肝外伤、肝门阻断及肝叶切除等过程中均不可避免，是影响上述疾病治疗效果和预后的重要原因之一。因此，如何减轻缺血再灌注肝的损伤是目前肝脏外科特别是肝移植外科的研究热点。目前国内外防治HIRI多采用针对某一损伤途径的拮抗剂，如抗氧化剂、抗凋亡药物、黏附分子拮抗剂和选择素拮抗剂等。这些药物虽然有一定的疗效，但是难以达到理想的保护治疗效果，有些甚至有较大的副作用，因此寻求一种安全、高效、低廉的药物一直是HIRI研究者努力的方向。

Yamaguchi等应用ESR分光术发现GSPE除了能清除超氧自由基及羟基自由基外，尚有清除甲基自由基的作用〔7〕。Roychowdnury等发现应用GSPE预处理大鼠的星形胶质细胞可增加细胞内低水平的NO产量，保护内源性谷胱甘肽池，使星形胶质细胞对氢过氧化物的耐受性增加，提示除其本身的直接抗氧化作用外，还可通过保护内源性抗氧化物质而起到抗氧化损伤作用〔8〕。说明GSPE是一种很好的自由基清除剂、脂质过氧化抑制剂及抗氧化剂。另有研究提示GSPE在减轻兔MRI的同时，对其引起的细胞凋亡有明显的保护作用，说明GSPE抗氧化损伤的同时还能抗细胞凋亡〔9〕。

本课题研究结果显示，I∕R组血清ALT、AST的水平明显高于假手术组，说明缺血再灌注时，脂质过氧化反应等因素引起肝细胞发生损伤，膜通透性增加导致细胞内容物外漏。给予GSPE预处理后，血清ALT及AST的水平均明显降低，低于I∕R组（P＜0.05），提示GSPE对稳定肝细胞膜可能具有一定的作用。肝组织GSH-Px及SOD活性，MDA含量检测也显示：GSPE预处理组GSH-Px及SOD活性明显升高，高于I∕R组，与此同时MDA含量则明显低于I∕R组（P＜0.05），差异明显，具有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，GSPE清除氧自由基、减轻脂质过氧化反应，有效减轻了缺血再灌注引起的氧化损伤。肝组织病理改变显示：GSPE预处理组的肝损伤程度较模型组明显减轻，与上述结果一致。

近年来大量研究资料表明，HIRI时细胞死亡的方式可通过凋亡和坏死两条途径。HIRI发生时有多种基因参与了细胞凋亡的调控，如Bcl-2家族、Caspase家族、TNF受体家族等，其中Bcl-2是最重要的抗凋亡基因。Bax可与Bcl-2蛋白通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，加强表达Bax蛋白形成同源二聚体将加速细胞凋亡。免疫组化的结果显示，与I∕R组比较，GSPE预处理组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显增加，而凋亡蛋白Bax的表达则明显减少，说明GSPE具有对抗细胞凋亡的作用。

综上所述，GSPE对缺血再灌注损伤的肝脏具有一定的抗氧化损伤和抗凋亡的作用，从而为HIRI的防治提供了新的思路。

〔1〕王冰，汪根树.肝脏缺血再灌注损伤的发生机制研究进展〔J〕.器官移植，2010，1（5）：317-320.

〔2〕孟中良，张培建.肝窦内皮细胞缺血再灌注损伤防治的研究进展〔J〕.中国普通外科杂志，2009，18（9）:976-978.

〔3〕吴英俊，梁忆非，董嘉楠.葡萄籽原花青素的研究进展〔J〕.热带医学杂志，2010，10（8）：1025-1028．

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〔5〕MONTAGUT G，BLADE C，BLAY M，et al.Effects of a grape seed procyanidin extract（GSPE）on insulin resis⁃tances〔J〕.J Nutr Biochem，2010，21:961-967．

〔6〕LEE T，KWON H S，BANG B R，et al.Grape seed proan⁃thocyanidin extract attenuates allergic inflammation in mu⁃rine models of asthma〔J〕.J Clin Immunol，2012，32（6）: 1292-1304.

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〔9〕梁英，高海青，由倍安，等.葡萄籽原花青素对兔心肌再灌注损伤诱发的细胞凋亡保护作用〔J〕.山东大学学报，2006，44（10）：1036-1039.

（责任编辑 李 杨）

Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Hepatic Ischemia Reperfusion Oxidative Injury and Apoptosis

LIU Rengui1,ZHANG Zihua1,QIN Yan2,SU Juan2，YANG Jiwu1
（1.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan671000,China）

Objective:To study the effects of grape seed proanthocyanidin extract（GSPE）on antioxidation of hepatic ischemia reperfusion injury in rats,and the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax.Methods:Thirty SD male rats were randomly divided into three groups with 10 rats each.i.e.sham operation group,HIRI model group and GSPE preconditioning group（160 mg∕kg）.The content of GSH-Px,SOD,and MDA in hepatic tissues,and the content of ALT and AST in serum were assayed 3 hours later after reperfusion.The morphological variations of hepatic tissues in each group were compared by means of optical microscope.Effects of GSPE on Bcl-2 and Bax in hepatic tissues were tested by means of immunohistochemisty.Results:The content of ALT and AST in serum and MDA in hepatic tissues decreased significantly（P＜0.05）,and the content of GSH-Px and SOD in hepatic tissues increased remarkably（P＜0.05）in GSPE preconditioning group,compared with HIRI model;Observed by the optical microscope,the degree of liver cell injury in GSPE preconditioning group was remarkably slighter than that of HIRI model group. Immunohistochemical results showed that the content of Bcl-2 increased and Bax decreased significantly in hepatic tissues,compared with that in HIRI model（P＜0.05）.Conclusion:GSPE had some effects on antioxidation and anti-apoptosis of hepatic ischemia reperfusion injury.

GSPE;ischemia reperfusion;liver;oxidative injuries;proteins Bcl-2 and Bax

R657.3

A

1672-2345（2014）08-0011-04

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.004

云南省教育厅基金资助项目（0900158）

2014-02-20

2014-05-04

刘仁贵，副主任医师，主要从事普外基础与临床工作研究.