VNTR技术用于大理地区结核分枝杆菌基因分型的研究

董 毅，吴利先

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

结核病是全球流行的传染病之一，该病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb，俗称结核杆菌）引起的慢性传染病，可累及全身各器官。全球有1/3的人口感染了结核杆菌〔1〕，该细菌具有潜伏感染的特点。随着分子生物学的发展，通过基因分型可了解结核分枝杆菌的流行和感染情况。为初步了解大理地区结核分枝杆菌的基因分型及流行特征，本研究采用VNTR基因分型技术对大理地区60株临床分离结核分枝杆菌菌株进行基因多态性分析，为结核病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 60株结核分枝杆菌由大理州疾病预防控制中心提供的结核患者的临床分离株；结核分枝杆菌标准株H37Rv DNA由大理学院基础医学院微生物学与免疫学实验室保存，作为本次试验的对照。

1.2 主要试剂 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP购自北京天根生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 超净工作台；台式高速离心机；PCR仪；全自动凝胶成像分析系统；电泳仪；隔水式恒温培养箱；超纯水机等。

1.4 结核分枝杆菌DNA模板制备 采用常规Lowenstein-Jensen培养基培养，37℃培养4～6周，有菌落生长后，在生物安全柜中取生长良好的结核菌落溶于500 μL TE缓冲液（pH 8.3）中，100℃煮沸30 min，12000 r/min离心5 min，取上清备用，-20 ℃保存备用。

1.5 VNTR位点的选择 参考国内外文献和基因数据库〔2-3〕，筛选了3个VNTR位点，引物序列由北京天根生物科技有限公司合成。见表1。实验中以标准株H37Rv DNA相对分子量为参照标准。

表1 引物序列、重复片断大小及其在H37Rv中的重复次数

1.6 VNTR-PCR 采用25 μL PCR反应体系，包括3 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，Taq Mixture（含Taq DNA 聚合酶，dNTP，MgCl2等）12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，分别用3对引物进行扩增。

PCR反应条件：预变性95℃3 min；循环94℃40 s，77.3℃ 40 s，72℃ 40 s共35个循环；最后72℃延伸5 min；4℃保存备用。

1.7 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物经3%琼脂糖凝胶恒电压（10 V/cm）电泳，溴化乙锭染色，应用100 bp DNA Ladder作为分子量Marker，标准菌株H37Rv DNA做标准对照。在紫外凝胶成像分析系统下观察结果，保存图片。

1.8 结果分析 应用100 bp DNA Ladder作为分子量Marker，采用Quantity one软件对图片进行数字化处理，计算出每个VNTR特异位点的重复次数，制作Excel表格，再用BioNumerics 6.6软件进行聚类分析。

2 结果

本实验研究选取了3个VNTR位点对分离自大理地区60株结核分枝杆菌进行了基因分型。见图1～2。

运用软件BioNmerics 6.6软件进行聚类分析，采用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arith⁃metic Mean，非加权组平均法）将大理地区结核分枝杆菌分为4个基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群）28个基因型。Ⅰ群占15.0%，含有5个基因型，Ⅱ群占31.7%，含有8个基因型，Ⅲ群占40.0%，含有11个基因型，Ⅳ群占13.3%，含有4个基因型。Ⅲ群所占比例最大，标准菌株也在该群，为大理地区重点防治的类型。见图3。

图1 部分菌株在Qub-11b位点多态性检测结果

图2部分菌株在Qub-4156位点多态性检测结果

3 讨论

目前国内外对结核分枝杆菌分型技术主要分为非核酸法（传统方法）和核酸法（分子生物方法），DNA指纹技术基因检测在实验室污染问题、暴发流行的调查、医院内结核病传播等方面取得了重大进展，展示了良好的前景〔4〕。现行的分子生物学方法主要为间隔区寡核苷酸分型技术（Spoligotyping）、插入序列限制性片段长度多态性分析（IS6110-RFLP）、VNTR、脉冲场凝胶电泳（PFGE）〔5-9〕等技术。IS6110-RFLP作为结核分枝杆菌基因分型的金标准，但操作复杂，结果分析困难〔10-11〕。

随着分子生物学的飞速发展以及结核分子杆菌H37Rv基因组的测定，发现结核分枝杆菌中存在数目可变串联重复序列（VNTRs）。运用该方法对结核分枝杆菌进行基因分型，操作简单可靠、重复性好、分辨率接近金标准，正被全球广泛应用于结核分枝杆菌基因分型和结核分子流行病的研究〔12-13〕。

图3 60株结核分枝杆菌BioNumerics聚类分析图

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