哺乳动物细胞线粒体基因组的转录及调控机制研究进展

熊 伟，张海洋，杨红娟，杜亚曼

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

线粒体是在各类真核细胞中广泛存在的由双层膜包被的细胞器，直径在0.5～10 μm左右。真核细胞各自拥有的线粒体在大小、数量及外观等方面上都有所不同。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，是一种重要的半自主性细胞器，在生物能量转换和新陈代谢中处于中心地位，所以被称为“细胞的动力工厂”。细胞行使各种生命活动所必需的能量，大约95%来源于线粒体氧化磷酸化过程产生的ATP。此外，线粒体也涉及细胞的其他重要功能，比如脂肪酸的代谢、细胞的程序性死亡、活性氧自由基的产生、三羧酸循环以及钙离子的转运等。存在于真核细胞线粒体内的核外线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA），称为线粒体基因组，线粒体的功能受核基因组和线粒体基因组的双重控制。研究表明，哺乳动物线粒体DNA以类核的形式存在于线粒体基质中，其拷贝数可以是一个或者多个，有独立自主的DNA复制、转录和蛋白质合成系统〔1〕。其中哺乳动物线粒体基因组的转录与调控机制研究一直是医学研究和生命科学研究的热点问题，本文归纳和总结了近年来线粒体转录调控相关因子的研究进展。

1 哺乳动物线粒体基因组的结构

哺乳动物细胞mtDNA多为双链、闭合环状DNA分子。人mtDNA全长有16596 bp，根据两条链的G+T含量不同和变性氯化铯密度梯度离心分为重链（H链）和轻链（L链）。见图1。线粒体基因组共编码了2个rRNA，22个tRNA和13个氧化呼吸链蛋白亚基。其中，重链编码的基因有2个rRNA（12s rRNA和16s rRNA），14个tRNA，2个ATP酶的亚基（ATPase 6和ATPase 8），3个细胞色素氧化酶亚基（COX I，COX II，COX III），细胞色素b亚基（cytb）和6个NADH脱氢酶亚基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5），轻链编码的基因有8个tRNA和1种蛋白（ND6）。哺乳动物的mtDNA基因排列都十分紧密，基因之间没有间隔，没有内含子，tRNAPhe基因和tRNAPro基因之间一段长约1.1 kb的片段是仅有的非编码区，称为D-loop区，包括了H链复制起始位点（OH），L链转录启动子（LSP）和mtDNA转录所需的一些顺式作用元件，如中央保守区序列（Central conserved sequence blocks domain，CSB），终止相关序列（Termination-associat⁃ed sequence，TAS），TFAM结合位点等〔2〕。

注：OrH和OrL表示重链和轻链复制起点，HSP和LSP表示重链和轻链转录启动子（箭头表示方向），粗线区表示rRNA和编码蛋白的基因，圆圈表示tRNA基因。方框表示MTERF结合位点。

2 哺乳动物线粒体基因组的转录单元与调控机制

哺乳动物mtDNA上一共有3个转录起始位点，即2个H链转录起始位点（HSP1，HSP2）和1个L链转录起始位点（LSP）。HSP1位于tRNAPhe基因上游16 bp处，转录终止于16S rRNA基因的3′末端，编码大量rRNA。HSP2位于12S rRNA基因5′末端附近，转录产生一条几乎覆盖整条H链的多顺反子mRNA。位于D-loop区域的LSP，转录产生一条完整的L链多顺反子RNA〔3〕。见图2。

图2 哺乳动物线粒体基因组转录调控模式图

哺乳动物mtDNA转录过程需要很多蛋白质和转录因子的共同参与，目前研究初步确认了哺乳动物细胞中组成mtDNA转录装置的成员，主要包括线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，mtTFA or TFAM）、转录因子B（mitochondrial tran⁃scription factor B，mtTFB or TFBM）、线粒体RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，mtRPOL or POLRMT）以及线粒体转录终止因子（mitochondrial transcription termination factors，MTERFs）等多种重要的转录因子。

2.1 线粒体RNA聚合酶（POLRMT or mtRPOL）线粒体RNA聚合酶属于类T7 RNA聚合酶家族，是线粒体中仅有的一种由核基因组编码的RNA聚合酶〔4〕。线粒体RNA聚合酶最早在酵母细胞中发现（称为Rpo41），后来才在人类细胞中发现。酵母线粒体RNA聚合酶的大亚基和噬菌体的单体RNA聚合酶同源，而小亚基和细菌RNA聚合酶中决定转录起始的因子有关，因此真核细胞线粒体RNA聚合酶可以看作是介于最简单的噬菌体RNA聚合酶和具有中等复杂程度的细菌RNA聚合酶之间的复合体〔5〕。人类POLMT基因定位于19p13.3，cDNA全长3831 bp，其编码的蛋白质由1230个氨基酸残基构成，N端的41个氨基酸残基为该蛋白定位线粒体的前导肽，C端则包含一系列的保守结构域。进入线粒体后，成熟的POLRMT由1189个氨基酸残基构成。POLRMT在细胞线粒体内不能进行特异的基因转录，需要在TFAM、TFB1M或TFB2M等转录因子的存在才能启动线粒体DNA的转录〔6〕。Maniura-Weber等在体外重建线粒体DNA转录体系的实验也证实了这一点〔7〕。

2.2 线粒体转录因子A（TFAM or mtTFA） 线粒体转录因子A是最先发现的线粒体转录起始调节因子，其在mtDNA的复制、转录、mtDNA类核结构的形成和mtDNA修复等方面都发挥着很重要的作用。TFAM以二聚体形式结合到线粒体基因组HSP和LSP特异序列上，通过线粒体RNA聚合酶的作用，在体内和体外都能调节mtDNA重链基因和轻链基因的转录。对哺乳动物TFAM基因结构的研究发现，该基因定位于10q21，共有7个外显子和6个内含子。其中，根据序列长度的不同，这6个内含子被分为2组，I、III和VI号内含子小于600 bp，而另外3个内含子则均大于1.8 kb。人类的TFAM是一个25 kDa大小的蛋白质分子，属于以弯曲、缠绕、伸展和结合为特征的高迁移蛋白家族（HMG box蛋白家族）的成员之一。它包含两个由27个氨基酸残基连接的HMG结构域和一个由25个氨基酸残基组成的C末端尾巴〔8〕。其中，C末端尾巴是TFAM特异性识别和结合DNA的结构，对于线粒体DNA的特异性转录有非常重要的作用。Larsson等发现敲除TFAM基因的小鼠由于mtDNA损耗会导致胚胎致命性损伤，说明TFAM对于维持mtDNA的完整性和细胞的生存是必须的〔9〕。最初的研究认为，TFAM是一个小的碱性蛋白，能够与HSP和LSP上游-12～-39 bp处的识别位点结合〔10〕。但随着研究的深入发现，在哺乳动物细胞中，mtDNA几乎是被TFAM包绕起来的，TFAM对于mtDNA来说是过量的〔11〕。Dairaghi等的体外转录实验显示，当体系中的hTFAM终浓度达到0.7 nM时开始出现LSP特异性转录产物，并在hTFAM终浓度达到70 nM时转录效率最高，超过这一浓度逐渐下降，当hTFAM终浓度达到7000 nM时，由LSP起始的转录几乎完全被抑制〔12〕，可能是由于与TFAM结合得越多，mtDNA越难以接近其它的转录因子，导致降低转录的速度。细胞中TFAM的表达水平可能是依据不同细胞特定的代谢情况来调节mtDNA的包装和转录活性，低浓度的hTFAM对线粒体H链和L链的转录有明显的激活作用，但存在一个饱和值，hTFAM浓度过高反而会导致H链和L链的转录水平下降或完全被抑制，但在一般情况H链和L链TFAM的转录水平是接近的〔13〕。在体外研究中发现，TFAM表达水平的高低直接影响TFB1M/POLRMT以及TFB2M/POLRM的转录起始活性，二者之间存在着剂量效应关系〔11〕。由核编码的TFAM调节mtDNA的复制和转录的精细机制尚未完全证实。另外，也有报道认为TFAM还参与了哺乳动物mtDNA的复制和损伤修复过程〔14〕。

2.3 线粒体转录因子B（TFBM or mtTFB） 线粒体转录因子B（TFBM）是在哺乳动物线粒体裂解物中发现的一种与RNA甲基转移酶同源的蛋白因子，它与酿酒酵母中的单体转录因子sc-TFB同源〔15〕。人类TFBM有两个亚型，分别命名为TFB1M和TFB2M，编码它们的基因分别定位于6q25.1和1q44。通常，TFB1M的转录活性是TFB2M的1/10，研究发现，除了甲基转移酶的活性，TFB1M主要在线粒体中核糖体的生成和蛋白翻译的调节中发挥作用。人类线粒体TFB1M可以使核糖体12S rRNA小亚基保守茎环的一系列腺嘌呤甲基化；深入研究发现，TFB1M是一种具有双重功能的蛋白质，既有转录因子的活性，也有rRNA甲基转移酶的活性〔15〕。TFB2M可能在物种进化的过程中丢失了甲基转移酶的功能而成为一个更加高效的转录因子。Adán等在黑腹果蝇Schneider细胞中采用RNAi的方法下调了TFB2M的水平，导致线粒体中RNA转录本的丰度下降了2～8倍〔16〕。然而，用同样的技术沉默TFB1M基因后线粒体中RNA转录本没有明显变化，却导致线粒体中蛋白质的表达水平显著下降，这一现象提示TFB1M可能在翻译调节过程中发挥重要的作用，TFB2M则是真核生物中重要的转录调控因子〔17〕。

体外模拟人mtDNA转录体系的研究发现，TFB2M的转录活化效率要比TFB1M至少高两个数量级。TFB1M或TFB2M与POLRMT可以直接形成一种异源二聚体，随着TFB2M的增加，转录速率加快，而且还发现这两个TFBM转录因子都能够通过TFAM羧基末端尾巴发生蛋白质-蛋白质相互作用。当mtTFB2M与mtRNA pol的比例达到1:1时，转录速率达到最大〔18〕。

线粒体DNA转录的起始很可能是这样一个过程：TFAM特异性的结合到HSP和LSP上游的识别位点，由于TFBM也能与TFAM的C-末端亲和接触，从而把TFBM-mtRPOL带到转录起始位点，通过蛋白-蛋白相互作用形成转录启动复合体来提高转录起始的效率〔19〕。

2.4 线粒体转录终止因子（MTERFs） 真核细胞线粒体转录终止因子是一类由核基因组编码转运到细胞线粒体，且能够与mtDNA特异结合的单体蛋白，它们的分子量大小为40 kDa左右，在线粒体复制、转录和翻译中发挥调控作用〔20〕。到目前为止已经鉴定出的动物线粒体转录终止因子有3种：果蝇的DmTTF、海胆的mtDBP、人类的MTERF，它们都能够与POLRMT结合，但与mtDNA结合的位点因不同物种而异〔20-21〕。人MTERF1基因定位于7q21，包含有两个外显子，其编码的蛋白产物分子量为39 kDa。MTERF1在线粒体转录中起终止作用，其终止位点在16S rRNA和leucyl-tRNA基因联结处。线粒体的转录终止因子MTERF1能结合双向终止位点，促进线粒体基因转录的终止。线粒体肌病脑病伴乳酸中毒及中风样发作综合症（MELAS）的A3243G点突变导致能解除16S rRNA转录终止，并且能减低MTERF1蛋白与线粒体DNA的亲和力。研究结果提示，MTERF1蛋白与人类线粒体疾病的产生存在着密切的联系。进一步的研究发现在人类中还存在一些与MTERF1序列高度同源的蛋白（MTERF2-F4），它们在线粒体基因表达调控中发挥着不同的作用，所以将它们归纳为人线粒体转录终止因子蛋白家族〔20-22〕。利用PSI-BLAST的方法与美国NCBI数据库中蛋白质序列比对显示，MTERF蛋白家族成员普遍存在于植物与后生动物中，但在真菌中尚未发现与其同源的蛋白质〔22〕。动物实验研究表明，在小鼠中敲除MTERF2后线粒体mRNA水平下降，氧化磷酸化水平也出现下降。因此推测MTERF2蛋白可能在mtDNA转录中起正调控作用〔23〕。2007年Park等在Cell杂志上首次报道了哺乳动物细胞内存在的一个负性调控mtDNA转录的因子——核基因组编码的MTERF3蛋白，此蛋白为哺乳动物胚胎发育所必需，敲除MTERF3蛋白的动物细胞内mtDNA重链和轻链的转录起始活性都显著增加。通过体内染色质免疫共沉淀技术（Chro⁃matin immunoprecipitation，ChIP）研究显示，MTERF3通过与mtDNA启动子区结合来行使转录抑制作用〔24〕。可以预见的是，对MTERF蛋白家族各成员的深入研究将为人们进一步阐明和理解mtDNA转录调控的分子机制奠定基础。

3 问题和展望

随着近些年来人们对于哺乳动物mtDNA转录及调控机制研究的不断深入，迄今已经初步明确了哺乳动物细胞中组成mtDNA基本转录装置的元件，主要包括TFAM、TFB1M、TFB2M和POLRMT，以及MTERFs等多种调控蛋白，但对mtDNA在机体不同生理条件和病理条件下转录和翻译的分子调控机制（如线粒体基因与核基因的相互作用，组织特异性的调节机制、调控水平和程度等）以及线粒体内核糖体生物发生过程等细节内容并不十分清楚，有待于进一步的研究探索。因此，人们仍在努力寻找着新的线粒体基因表达调控蛋白。对哺乳动物细胞mtDNA转录过程及调控机制的进一步研究，不仅有助于深入阐明和理解线粒体基因组的表达调控机制，而且也助于揭示临床线粒体病（如Laber遗传性视神经病、Kearns－Sayre综合征、MELAS、阿尔茨海默病、帕金森症、线粒体糖尿病和母系遗传性耳聋等）的发病机制，并为寻找新的线粒体基因治疗的靶标奠定基础〔25〕。

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