蜀葵根预防和治疗大鼠肾草酸钙结石的效果评价及机制初探*

姚家喜 钱 彪 王勤章 丁国富 李应龙 李 强 倪 钊 王新敏 王江平 王文晓

蜀葵根预防和治疗大鼠肾草酸钙结石的效果评价及机制初探*

姚家喜 钱 彪 王勤章△丁国富 李应龙 李 强 倪 钊 王新敏 王江平 王文晓

目的 评价蜀葵根预防及治疗大鼠肾草酸钙结石的效果，并初步探讨其机制。方法将60只雄性Wistar大鼠随机分为对照组，模型组，蜀葵根低剂量预防组、高剂量预防组、低剂量治疗组、高剂量治疗组。对照组给予自由进食水，模型组给予1%乙二醇自由饮水及进食，预防组每天给予1%乙二醇饮水及蜀葵根提取物灌胃（低剂量250 mg/kg，高剂量500 mg/kg），治疗组开始给予1%乙二醇饮水，第15天开始添加蜀葵根提取物（低剂量250 mg/kg，高剂量500 mg/kg）。实验结束时，利用大鼠尿液、血液及肾脏匀浆标本，检测大鼠尿量、钙、磷、镁、尿素、草酸、血肌酐及肾脏匀浆参数。显微镜下观察肾组织切片中草酸钙结晶沉积及病理变化。结果与对照组相比，模型组大鼠尿量、血肌酐、血尿素氮、尿草酸、尿钙、肾脏匀浆丙二醛（MDA）及肾组织内草酸钙结晶评分明显升高（P＜0.05），肾脏匀浆谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）含量明显下降（P＜0.05）。与模型组比较，预防组、治疗组大鼠血肌酐、血尿素氮、尿草酸、尿钙、肾脏匀浆MDA含量及肾组织内结晶评分明显下降（P＜0.05），肾组织匀浆GSH、SOD含量明显升高（P＜0.05）。肾组织病理学显示蜀葵根提取物预防组及治疗组大鼠肾内草酸钙结晶沉积较模型组明显减少，肾组织损伤较模型组明显减轻。结论蜀葵根可以有效预防和治疗大鼠肾草酸钙结石，保护肾功能。

蜀葵属；草酸钙；肾结石；蜀葵根

肾结石由于发病率及复发率较高，已经成为困扰患者生活的严重问题，其具体发病原因不明，目前主要治疗方法为手术治疗[1]。蜀葵又名一丈红，是一种具有多种药用价值的植物，原产我国西南地区，在全国各地广泛栽培。蜀葵以根、叶、花、种子入药，清热解毒、利尿。蜀葵花也是维吾尔、蒙古等少数民族常用中草药。《本草纲目》记载：其花气味甘、寒、滑、无毒，主治小便淋沥及催生。蜀葵还广泛生长于南欧和亚洲，药理学报道其有抗炎、抗菌、镇痛作用[2]，是伊朗治疗疾病的传统医药，但其体内预防及治疗肾结石的作用尚少见研究报道，本文旨在通过构建大鼠肾结石模型，研究蜀葵治疗肾结石的效果、安全性及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体质量（220±20）g，购自新疆维吾尔自治区实验动物中心，饲养环境温度(20±2)℃，相对湿度(50±5)%，光照周期12 h/12 h，自由饮水和标准实验室饮食。

1.1.2 实验试剂及仪器 蜀葵根提取物（陕西龙孚生物化工有限责任公司），乙二醇（天津市富宇精细化工有限公司），硝酸银（北京索莱宝科技有限公司），光学显微镜、全自动生化分析仪（日本Olympus公司），LEICA石蜡切片机、LEICA双目显微镜（德国LEICA公司），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型制备 采用随机数字表法将实验大鼠分为对照组、模型组、低剂量预防组、高剂量预防组、低剂量治疗组、高剂量治疗组，每组10只。以蒸馏水为溶剂配置蜀葵根提取物混悬液灌胃，对照组自由进食水，模型组给予1%乙二醇自由饮水[3]，低剂量预防组给予1%乙二醇自由饮水及蜀葵根提取物250 mg/（kg·d）灌胃，高剂量预防组给予1%乙二醇自由饮水及蜀葵根提取物500 mg/（kg·d）灌胃，低剂量治疗组给予1%乙二醇自由饮水并在第15天时给予蜀葵根提取物250 mg（/kg·d）灌胃直至实验结束，高剂量治疗组给予1%乙二醇自由饮水并在第15天时给予蜀葵根提取物500 mg（/kg·d）灌胃，直至第28天实验结束。每隔1 d称量大鼠体质量，同时观察实验大鼠的一般状况。

1.2.2 指标检测 大鼠代谢笼收集大鼠24 h尿液，检测24 h尿量、尿pH值、Ca2+、Mg2+、尿草酸含量。第28天大鼠麻醉后心脏取血，全自动生化分析仪检测血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、P、Ca2+、Mg2+含量。取血后处死大鼠，切取双肾，于冰冷的生理盐水中迅速清洗，吸干表面水分。右侧肾脏置于0.02 mol/L的pH值为7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液10 mL中匀浆，按照试剂盒说明检测肾脏SOD、GSH、MDA含量。左侧肾脏用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，做常规HE染色切片和矿化结节（Von kossa）染色切片，光学显微镜下观察肾组织草酸钙结晶形态、分布及肾组织病理改变，并在10倍镜视野下对结晶数量进行评分[4]，无结晶计0分，1～10个结晶计1分，11～30个结晶计2分，31～50个结晶计3分，51～75个结晶计4分，多于75个结晶计5分。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜀葵根提取物对大鼠一般情况的影响 实验过程中无大鼠死亡，实验中观察到模型组大鼠毛色无光泽，杂乱，精神萎靡，畏寒、不思饮食。对照组大鼠体形丰满，精神状况良好，饮食活动正常。实验组（高低剂量预防及治疗组）一般状况介于两者之间。

2.2 蜀葵根提取物对大鼠尿量及尿生化指标的影响 模型组大鼠24 h尿量明显高于对照组，蜀葵根预防组、治疗组24 h尿量明显高于对照组和模型组（P＜0.05）。模型组、预防组及治疗组的尿草酸高于对照组，预防组及高剂量治疗组尿草酸低于模型组（P＜0.05）。模型组、低剂量预防组、低剂量治疗组24 h尿Ca2+明显高于对照组，高剂量预防、高剂量治疗组24 h尿Ca2+明显低于模型组（P＜0.05）。各组24 h尿pH值及Mg2+差异无统计学意义，见表1。

Table 1 Effect of Alcea rosea roots on urinary parameters in wistar rats with urolithiasis表1 蜀葵根提取物对各组大鼠尿液指标的影响 （n=10±s）

＊P＜0.05,a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组低剂量预防组高剂量预防组低剂量治疗组高剂量治疗组F 24 h尿量（mL/24 h）13.82±3.52 20.24±3.27a25.68±1.06ab35.36±2.27ab28.00±3.70ab30.14±3.94ab103.983＊pH值6.00±0.01 5.60±0.22 6.00±0.72 5.60±0.22 5.70±0.25 6.00±0.01 4.429草酸（μmol/24 h）37.08±13.40 121.49±29.19a85.33±5.90ab61.47±7.55ab108.91±7.81a95.28±6.25ab94.365＊Ca2+（μmol/24 h）7.61±1.72 17.71±2.04a12.89±0.06a8.31±0.55b14.68±0.41a10.93±0.30b30.809＊Mg2+（μmol/24 h）28.95±1.27 24.77±1.16 28.52±5.16 25.12±2.06 23.60±5.92 28.87±5.96 11.384

2.3 蜀葵根提取物对大鼠血生化指标的影响 模型组大鼠血BUN、Cr水平明显高于对照组（P＜0.05），与模型组比较，蜀葵根预防组和治疗组血BUN、Cr水平明显下降（P＜0.05）。各组大鼠血P、Ca2+、Mg2+含量差异无统计学意义，见表2。

2.4 蜀葵根提取物对大鼠肾脏指标的影响 模型组大鼠肾脏GSH、SOD含量低于对照组，蜀葵根预防组、治疗组GSH、SOD含量与模型组相比明显升高（均P＜0.05）。模型组大鼠肾脏MDA含量高于对照组，蜀葵根高剂量预防组、高剂量治疗组MDA含量与模型组相比明显下降（P＜0.05）。蜀葵根预防组、治疗组肾脏草酸钙结晶评分明显高于对照组，低于模型组（P＜0.05），见表3。

2.5 蜀葵根提取物对大鼠肾脏组织草酸钙沉积的影响 肉眼观察，对照组大鼠肾脏大小、色泽正常，触之柔软。模型组大鼠肾脏皮质、髓质分界不清，用手触摸有明显的磨砂感，光学显微镜下观察，HE染色切片的草酸钙晶体为淡灰色至白色透明状晶体，见图1；矿化结节染色切片的草酸钙晶体呈黑色，见图2。组织病理学分析显示，对照组肾组织无明显病理变化及草酸钙晶体沉积。模型组大鼠肾组织内有大量草酸钙晶体形成，主要存在于肾髓质内，肾乳头及肾皮质亦有草酸钙晶体沉积，肾小管上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔明显扩张，管腔内可见草酸钙晶体沉积及脱落的上皮细胞；肾间质可见到明显的慢性间质性炎症。与模型组比较，蜀葵根预防组、治疗组大鼠肾组织内草酸钙晶体沉积明显减少，肾小体结构破坏减轻，肾小管管腔扩张程度较轻，管腔内无明显的坏死脱落样的物质，病理损伤减轻。

Table 2 Effect of Alcea rosea roots on serum parameters in wistar rats with urolithiasis表2 蜀葵根提取物对各组大鼠血液指标的影响 （n=10±s）

＊P＜0.05,a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组低剂量预防组高剂量预防组低剂量治疗组高剂量治疗组F BUN（mmol/L）7.99±0.49 28.24±5.62a12.08±0.51ab9.48±0.16b15.83±1.03ab10.98±0.17b189.137＊Cr（μmol/L）54.54±11.22 156.84±26.04a99.56±1.98ab68.16±5.71b120.94±6.57ab114.08±1.55ab240.583＊P（mmol/L）2.50±0.20 2.62±0.18 2.72±0.19 2.68±0.13 2.88±0.49 2.65±0.25 20.062 Ca2+（mmol/L）2.58±0.10 2.64±0.25 2.65±0.08 2.62±0.02 2.66±0.05 2.56±0.06 5.795 Mg2+（mmol/L）0.86±0.09 0.88±0.08 0.95±0.12 0.88±0.12 1.00±0.44 0.86±0.05 11.382

Table 3 Effect of Alcea rosea roots on kidney parameters in wistar rats with urolithiasis表3 蜀葵根提取物对各组大鼠肾脏匀浆指标的影响 （n=10±s）

＊P＜0.05,a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05

组别对照组模型组低剂量预防组高剂量预防组低剂量治疗组高剂量治疗组F GSH（μmol/g蛋白）908.83±123.93 485.61±122.58a601.27±140.97ab856.99±120.60b728.76±111.29ab785.57±125.23ab73.232＊SOD（U/mg蛋白）3.58±0.28 1.56±0.22a2.55±0.57b2.97±0.41b2.14±0.23ab2.50±0.37b409.119＊MDA（nmol/mg蛋白）62.95±12.24 189.31±14.86a132.98±44.96a84.96±33.47b179.24±62.29a102.53±19.77b221.711＊结晶评分0 5.00±0.12a3.12±0.32ab1.18±0.14ab3.74±0.26ab2.80±0.15ab541.793＊

3 讨论

泌尿系结石产生是由于体内促进结石和抑制结石的条件失衡所致，结石的主要成分是草酸钙。文献报道表明，乙二醇诱导的雄性大鼠肾结石主要成分是草酸钙结石，形成原因是乙二醇导致体内草酸的排泄及草酸在尿液的浓度升高[5]。本研究结果发现蜀葵根提取物可以显著降低草酸排泄，但其作用机制仍不清楚，可能与下列因素有关。（1）高草酸尿是草酸钙结石形成的主要因素[6]，蜀葵根高剂量预防组及高剂量治疗组的尿液草酸及Ca2+含量明显低于模型组，说明蜀葵根可能抑制大鼠体内草酸形成，并降低尿钙浓度，从而抑制草酸钙结晶的形成。蜀葵根具有利尿作用，有利于草酸钙结晶的排出，减少结晶在肾脏的滞留。（2）已有研究报道表明蜀葵根具有抗炎及抗氧化作用[7-8]。本实验结果表明，蜀葵根给药之后，与模型组比较血BUN、Cr水平明显下降，表明蜀葵根可以保护肾功能，减轻肾脏损伤。蜀葵根预防组、治疗组肾脏GSH、SOD活性明显高于模型组，高剂量预防及治疗组的MDA活性低于模型组，说明蜀葵根可明显抑制草酸导致的肾脏脂质过氧化反应，清除氧自由基。而脂质过氧化反应产生活性氧，导致肾上皮细胞的损伤，形成细胞碎片，利于结晶黏附于肾小管内成核聚集。因此，蜀葵根提取物其内部化学成分的抗炎和抗氧化作用可以减少结晶在肾脏的滞留且保护肾功能。（3）有报道表明，蜀葵根可以分泌具有黏附作用的黏多糖[9]，因此，蜀葵根提取物可以通过阻碍草酸钙结晶与肾小管表面的附着位点结合，即在结晶表面形成保护膜阻止其与细胞表面黏附，从而抑制结晶的成核聚集及黏附。也有报道草酸钙结晶是由于细菌引起的，如纳米细菌。Ciftcioglu等[10]对72例肾结石患者进行纳米细菌培养和单克隆抗体免疫荧光染色鉴定，其中70例阳性。高文清[11]研究了蜀葵花提取物体外抑制细菌、真菌的活性，发现蜀葵根提取物也有抗菌作用。Seyyednejad[12]也证实蜀葵根提取物具有抗菌作用。因此不排除其具有抑制纳米细菌的作用，可能也是其抗结石的机制之一，但具体论证仍需进一步研究。

组织病理学显示在模型组大鼠肾小管管腔内有多形态、不规则的草酸钙结晶，伴管腔水肿及细胞脱落，近端小管扩张及间质性炎症，并有小管间出血及血管充血现象，与文献报道的现象一致[13]。蜀葵根预防、治疗组与模型组比较，不同程度降低了草酸钙结晶的大小和数量，减轻了肾小管的出血、水肿及炎症。表明蜀葵根提取物在一定程度上可以减少结晶的形成及减轻肾脏的损伤。目前的研究证明其在治疗肾结石方面是有效的，但是阐明这种效用的机制还需要进一步研究。

[1] 杨文增,宋士超,徐丽,等.经皮肾镜治疗肾结石合并单纯性肾囊肿疗效观察[J].天津医药,2013,41(5):498-499.

[2] Mert T,Fafal T,Kıvcak H,et al.Antimicrobial and cytotoxic activities of the extracts obtained from the flowers of alcea rosea L[J]. Hacet Univ J Pharm，2010,30（1）:17-24.

[3] Khajavi Rad A,Hadjzadeh MA,Rajaei Z,et al.The beneficial effect of cynodon dactylon fractions on ethylene glycol-induced kidney calculi in rats[J].Urol J，2011,8(3):179-184.

[4] Khan A,Khan SR,Gilani AH.Studies on the in vitro and in vivo antiurolithic activity of Holarrhena antidysenterica[J].Urol Res,2012, 40(6):671-681.

[5] Lin WC,Lai MT,Chen HY,et al.Protective effect of Flos carthami extract against ethylene glycol-induced urolithiasis in rats[J].Urol Res，2012,40(6):655-661.

[6]Moe OW.Kidney stones:Pathophysiology and medical management [J].Lancet，2006,367(9507):333-344.

[7]Ghaoui WB,Ghanem EB,Chedid LA,et al.The effects of Alcea rosea L.,Malva sylvestris L.and Salvia libanotica L.water extracts on the production of anti-egg albumin antibodies,interleukin-4,gamma interferon and interleukin-12 in BALB/c mice[J].Phytother Res，2008,22(12):1599-1604.

[8]Kardosova A.Antioxidant activity of medicinal plant polysaccharides [J].Fitoterapia，2006,77(5):367-373.

[9] Deters A,Zippel J,Hellenbrand N,et al.Aqueous extracts and polysaccharides from Marshmallow roots:cellular internalisation and stimulation of cell physiology of human epithelial cells in vitro[J].J Ethnopharmacol，2010,127(1):62-69.

[10]Ciftcioglu N,Vejdani K,Lee O,et al.Association between Randall's plaque and calcifying nanoparticles[J].Int J Nanomedicine, 2008,3(1):105-115.

[11]高文清.蒙药材蜀葵花提取物体外抑菌活性研究[D].呼和浩特:内蒙古医学院,2010.

[12]Seyyednejad SM.A survey on Hibiscus rosa sinensis,Alcea rosea L.and Malva neglecta Wallr as antibacterial agents[J].Asian Pac J Trop Med，2010,3(5):351-355.

[13]Divakar K,Pawar AT,Chandrasekhar SB,et al.Protective effect of the hydro-alcoholic extract of Rubia cordifolia roots against ethylene glycol induced urolithiasis in rats[J].Food Chem Toxicol，2010, 48(4):1013-1018.

（2013-09-13收稿 2013-10-28修回）

（本文编辑 闫娟）

Effects and Mechanism of Alcea Rosea Roots in Ethylene Glycol Induced Nephrolithiasis in Rats

YAO Jiaxi,QIAN Biao,WANG Qinzhang,DING Guofu,LI Yinglong,LI Qiang,NI Zhao,WANG Xinmin, WANG Jiangping,WANG Wenxiao
Department of Urology First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Xinjiang 832000,China

ObjectiveTo study the beneficial effect and mechanism of Alcea rosea roots in nephrolithiasis model induced by 1%ethylene glycol in rats.MethodsWe randomly divided 60 male Wistar rats into six groups，including control group,model group,Alcea rosea roots lower-dose preventive group,Alcea rosea roots high-dose preventive group,Alcea rosea roots lower-dose curative group,Alcea rosea roots high-dose curative group.Control group was free to access food and water;model group was given 1%ethylene glycol drinking water and was fed with normal diet,preventive group was given 1%ethylene glycol drink and Alcea rosea roots in low(250 mg/kg)or high dose(500 mg/kg)each day,curative group

1%ethylene glycol drink each day and Alcea rosea roots in low or high dose from day 15 to day 28.At the end of the experiment,various renal functional and injury markers such as urine volume,calcium,phosphate,magnesium,urea,creatinine,and oxalate were evaluated using urine,serum,and kidney homogenates.The kidneys were removed and prepared for histological evaluation of calcium oxalate deposits.ResultsIn model groups,urine output,urea,creatinine,24 h urine Ca2+,and oxalate and MDA were increased compared to those in control group（P＜0.05）.GSH and SOD were increased in preventative and curative groups compared to those in the model group（P＜0.05）.The urea,creatinine,24 h urine Ca2+, urine oxalate,MDA were reduced in preventive and curative groups compared to those in the model group（P＜0.05）.The number and size of calcium oxalate crystal deposits were also less and smaller,and the kidney damage was less severe in preventive and curative groups compared to in the model group.ConclusionThe extract of Alcea rosea roots can prevent and treat calcium oxalate urinary stone formation in rats and protect renal function.

althaea;calcium oxalate;kidney calculi;alcea rosea roots

R692.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.012

*石河子大学优秀青年项目（项目编号：2012ZRKXYQ-YD29）

新疆石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科（邮编832000）

△通讯作者 E-mail：wqz1969@sina.com